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近期，南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/藥物化學(xué)生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙強(qiáng)教授與Adam C. Midgley副教授在科愛(ài)出版創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表題為“Anti-Sca-1 antibody-functionalized vascular grafts improve vascular regeneration via selective capture of endogenous vascular stem/ progenitor cells”的研究論文。該研究利用血管干/祖細(xì)胞特異性標(biāo)志物Sca-1抗體對(duì)靜電紡絲技術(shù)制備的聚己內(nèi)酯人工血管進(jìn)行功能化修飾。功能化人工血管在植入體內(nèi)后可以通過(guò)選擇性捕捉內(nèi)源性血管干/祖細(xì)胞促進(jìn)血管組織再生。

01  研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

心血管疾?。–VD）因其高發(fā)病率和致死率，已成為全球范圍內(nèi)的重大公共衛(wèi)生問(wèn)題。近年來(lái)，由合成可降解材料制備的小口徑（< 6 mm）人工血管因其具有良好的生物相容性和力學(xué)性能受到了廣泛關(guān)注。然而，由于合成材料缺乏抗凝血活性和誘導(dǎo)組織再生的功能，血管植入體內(nèi)后常發(fā)生血栓和內(nèi)膜增生等問(wèn)題，導(dǎo)致血管再狹窄。因此，構(gòu)建具有誘導(dǎo)組織再生功能的活性生物材料是解決人工血管再狹窄問(wèn)題并實(shí)現(xiàn)其臨床轉(zhuǎn)化的有效途徑之一。

血管干/祖細(xì)胞（Stem/progenitor cell, SPC）具有自我更新和多向分化潛能，在維持血管穩(wěn)態(tài)和調(diào)控血管重構(gòu)中發(fā)揮重要作用。研究表明，SPC可以在體內(nèi)和體外條件下分化為血管細(xì)胞，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞（EC）和平滑肌細(xì)胞（SMC），是血管組織修復(fù)再生的重要細(xì)胞來(lái)源。

該研究首先利用靜電紡絲技術(shù)制備了聚己內(nèi)酯（PCL）人工血管。然后，通過(guò)生物素-親和素（Biotin-Avidin）反應(yīng)將Sca-1抗體修飾到PCL人工血管表面（圖1A），獲得了一種Sca-1抗體功能化修飾的人工血管（PCL-Sca-1 Ab）。在材料的制備和表征方面，該研究首先通過(guò)掃描電子顯微鏡（SEM）和激光共聚焦成像（CLSM）考察了PCL-Sca-1 Ab人工血管的微觀結(jié)構(gòu)和表面形態(tài)（圖1B和C）。其次，力學(xué)測(cè)試顯示了抗體修飾前后兩種人工血管的力學(xué)強(qiáng)度和爆破壓均能滿足體內(nèi)移植的要求（圖1D和F）。此外，表面功能化修飾提高了人工血管的親水性（圖1E），降低血小板和纖維蛋白原的粘附，從而改善人工血管的血液相容性（圖1G和H）。

圖1 Sca-1抗體功能化修飾的人工血管的制備與表征

為了考察Sca-1抗體功能化修飾后的人工血管對(duì)Sca-1+的血管干/祖細(xì)胞（Sca-1+ SPCs）的作用，研究人員首先從大鼠的血管外膜中分離出Sca-1+ SPCs。然后，在靜態(tài)培養(yǎng)的條件下比較了Sca-1抗體功能化修飾前后人工血管對(duì)Sca-1+ SPCs的粘附情況。此外，還利用3D流動(dòng)培養(yǎng)生物反應(yīng)器在模擬生理?xiàng)l件下比較了PCL和PCL-Sca-1 Ab人工血管對(duì)Sca-1+ SPCs的捕捉以及細(xì)胞在血管的駐留情況。結(jié)果表明，無(wú)論是在靜態(tài)還是流動(dòng)培養(yǎng)條件下，Sca-1抗體功能化修飾均顯著改善了人工血管對(duì)Sca-1+ SPCs細(xì)胞的粘附和捕捉（圖2）。

圖2 體外細(xì)胞粘附和捕捉實(shí)驗(yàn)

將PCL和PCL-Sca-1 Ab兩組人工血管分別移植到大鼠腹主動(dòng)脈來(lái)比較兩組人工血管的體內(nèi)組織再生情況（圖3）。在移植后的2周和4周時(shí)取材分析，通過(guò)H&E、番紅O、Masson和VVG染色來(lái)分別考察人工血管植入后組織再生和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的分泌。染色結(jié)果顯示，相比于PCL對(duì)照組，PCL-Sca-1 Ab的組織再生更好，而且人工血管的管壁中分布著更多的膠原和糖胺聚糖。

圖3 人工血管體內(nèi)移植后的組織再生情況

血管內(nèi)皮為防止血栓形成和再狹窄提供了良好的天然屏障，是維持人工血管長(zhǎng)期通暢的重要保障。因此，人工血管植入后的內(nèi)皮化程度是反映血管組織再生的一個(gè)重要指標(biāo)。在該研究中，研究人員通過(guò)SEM和En face免疫熒光染色觀察人工血管表面的內(nèi)皮覆蓋情況。結(jié)果顯示，PCL-Sca-1 Ab人工血管的內(nèi)皮覆蓋率顯著高于對(duì)照組，且再生的ECs呈鵝卵石樣形態(tài)，并沿血流方向規(guī)則排列，與天然動(dòng)脈相似（圖4）。

圖4 人工血管體內(nèi)移植后的內(nèi)皮再生情況

血管平滑肌層在維持血管的力學(xué)強(qiáng)度、調(diào)節(jié)血管的舒張收縮功能等方面發(fā)揮著重要作用。因此，研究人員分別用α-SMA和SM-MHC免疫熒光染色對(duì)再生平滑肌的表型進(jìn)行了考察（圖5）。α-SMA+的免疫熒光照片顯示，2周時(shí)PCL-Sca-1 Ab組可觀察到均勻分布的α-SMA+細(xì)胞，4周時(shí)細(xì)胞排列更為緊密。而PCL人工血管，2周時(shí)，α-SMA+細(xì)胞的再生有限，4周時(shí)，α-SMA+細(xì)胞數(shù)量有所增加（圖5A）。SM-MHC+平滑肌再生表現(xiàn)出類似的趨勢(shì)（圖5C）。

圖5 人工血管體內(nèi)移植后的平滑肌再生情況

體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Sca-1抗體功能化修飾提高了人工血管對(duì)Sca-1+ SPCs的粘附和捕獲。進(jìn)一步，研究人員在大鼠腹主動(dòng)脈移植模型中深入研究了Sca-1+ SPCs的體內(nèi)浸潤(rùn)情況（圖6）。結(jié)果顯示，在植入2周和4周后，PCL-Sca-1 Ab人工血管中Sca-1+ SPCs細(xì)胞的數(shù)量顯著高于對(duì)照組。這些Sca-1+ SPC可進(jìn)一步分化成為EC和SMC細(xì)胞，促進(jìn)血管組織再生。

圖6 人工血管體內(nèi)移植后的Sca-1+ SPCs的浸潤(rùn)和分化情況

接下來(lái)，研究人員利用Sca-1 2A-CreER; Rosa-RFP遺傳譜系示蹤小鼠并構(gòu)建了骨髓移植模型（BMT）來(lái)考察參與血管組織再生的SPCs的來(lái)源和命運(yùn)（圖7）。

圖7 利用骨髓移植模型并結(jié)合遺傳譜系示蹤小鼠揭示參與血管組織再生的Sca-1+ SPCs的來(lái)源和命運(yùn)

在BMT小鼠頸動(dòng)脈移植模型中，研究人員發(fā)現(xiàn)參與血管組織再生的Sca-1+ SPCs大部分來(lái)自血管外周組織，也有少量來(lái)自骨髓/外周血（圖7I）。這些募集的Sca-1+ SPCs會(huì)進(jìn)一步的向ECs和SMCs分化來(lái)參與血管組織再生（圖7K）。

綜上，該研究設(shè)計(jì)制備了一種Sca-1抗體功能化修飾的人工血管，其能夠捕捉內(nèi)源性血管干/祖細(xì)胞，有效改善血管組織再生。同時(shí)利用遺傳譜系示蹤小鼠并結(jié)合骨髓移植模型，進(jìn)一步考察了參與血管再生的干/祖細(xì)胞來(lái)源和分化情況。該研究成果不僅為功能型小口徑人工血管制備提供了新的策略，而且為血管干細(xì)胞和組織再生機(jī)制研究提供了有力的支撐。