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一、簡述

 

基于生物雜交的細菌微型機器人作為可能可控的外部靶向癌癥治療工具，已經(jīng)逐漸被人接受。而磁場被視作傳遞能量和引導它們運動，并且安全的重要手段。

到目前為止，在這一背景下使用的磁控制機器人依賴于可伸縮磁場梯度，同時需要主動位置反饋，不適合在人體內(nèi)的擴散分布。所以，作者提出了一種磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動的控制方案，以增強細菌微型機器人通過生物屏障的轉(zhuǎn)運過程，并且增強細菌對腫瘤核心的固有趨化性，使用磁螺旋菌作為模型生物。這種混合控制策略易于規(guī)?；瘮U展，獨立于位置反饋，適用于易于被循環(huán)系統(tǒng)分散的細菌微型機器人。

作者觀察到在血管內(nèi)皮模型中，磁性反應細菌的易位增加了四倍，并發(fā)現(xiàn)驅(qū)動運輸增加的主要機制是細胞界面轉(zhuǎn)矩驅(qū)動導致的表面探索。使用球體作為三維腫瘤模型，放置在旋轉(zhuǎn)磁場中，并在其信號高出21倍的核心區(qū)域用熒光標記細菌機器人的定植。

除了增強運轉(zhuǎn)外，作者還證明了這個控制方案的其他優(yōu)勢，包括基于感應檢測的閉環(huán)優(yōu)化的可能性，以及減少脫靶效應的空間選擇性驅(qū)動。最后，在小鼠全身靜脈注射后，可以發(fā)現(xiàn)細菌微型機器人在腫瘤的聚集顯著增加，支持了將該控制方案應用于臨床的可能性。

圖 沙門氏桿菌圖

二、介紹

 

結(jié)合了細胞和合成成分的生物雜交細菌微型機器人有望改善腫瘤治療的方案，因為它們有自主驅(qū)動力，且能夠自主響應，并且攜帶能夠治療腫瘤的有效載荷?；诩毦奈⑿蜋C器人有特別的功能，它們有免疫調(diào)節(jié)能力，以及某些菌株表現(xiàn)出的腫瘤導向性和優(yōu)先定植性。

在機器人領域之外，直接使用細菌進行腫瘤治療的研究已經(jīng)進行了一個多世紀，并且已經(jīng)在各種動物模型中進行了大量的基因工程和減毒菌株測試。此外，沙門氏菌、分枝桿菌和梭狀芽孢桿菌的菌株已經(jīng)進展到人體臨床試驗階段。然而，由于在腫瘤中的定植不足而導致的臨床反應不完全，阻礙了這種方法的臨床轉(zhuǎn)化。改變控制方法以增強和加快細菌在腫瘤內(nèi)的積累，對于限制免疫系統(tǒng)清除，促進細菌定植，降低細菌劑量，從而提高治療效果和安全性是至關重要的。

生物混合微型機器人通過感受外部刺激(包括化學梯度、光、電場和磁場)的變化實現(xiàn)無線控制。其中，磁場由于其微創(chuàng)、在組織深部穿透性良好和臨床安全性，因此在醫(yī)學上有很大的應用前景。對磁性有反應的細菌，包括通過與磁性材料結(jié)合而產(chǎn)生帶有磁性的菌株和天生具有磁性的趨磁細菌(MTB)，在原生環(huán)境中，MTB通常將穩(wěn)定磁化的各向磁性納米顆粒生物礦化，并利用磁場輔助遷移到氧濃度低的區(qū)域。在體內(nèi)定向磁場(DMF)或磁場梯度存在的情況下，在腫瘤周圍注射后，攜帶有效載荷的MTB菌株優(yōu)先在腫瘤的脫氧區(qū)域增殖。

盡管基于磁性細菌的微型機器人是很有前途的藥物傳遞媒介，但到目前為止，它們在臨床轉(zhuǎn)化方面依舊有限制。這種控制策略會導致微機器人在體內(nèi)的分散分布，因此不適合全身注射。而DMF控制需要在腫瘤周圍給藥，只能應用于淺層的腫瘤。

在這項研究中，作者建立了一種混合控制方法，利用磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動運動和自主導航，用磁螺旋菌AMB-1菌株作為磁響應模型生物和共價偶聯(lián)脂質(zhì)體（MTB-LP）載體的滲透性（圖1）。均勻旋轉(zhuǎn)磁場(RMF)可以在臨床上應用，控制分散的微型機器人，并且不依賴于視覺反饋。

 

圖  磁性增強MTB脂質(zhì)體綴合物轉(zhuǎn)運混合控制方案的概念概述

 

三、實驗結(jié)果

 

RMF增強細菌易位，并提供獨特的控制優(yōu)勢

之前已經(jīng)使用了一系列的方法來操作MTB，將其作為使用外部磁場的微型機器人(圖2A)。在DMF存在的情況下，細菌的運動依賴于鞭毛產(chǎn)生的推進力(FP)和流體阻力(FD)，兩者在勻速運動時方向等值相反。

MTB自推進被DMF覆蓋時，來自周圍流體的粘性阻力在外場與MTB的磁矩之間產(chǎn)生了相位滯后，產(chǎn)生了施加在細菌上的磁轉(zhuǎn)矩。磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動的運動產(chǎn)生的力比MTB自行推進產(chǎn)生的力高一個數(shù)量級。靜態(tài)場梯度也被用于將MTB拉向目標位置。雖然這種方法已經(jīng)在小動物模型中顯示出了效果，但要在相同的磁矩上產(chǎn)生相當?shù)牧?，需要一個超過1300 T/m的梯度，這是不現(xiàn)實的（詳細計算可見文獻原文補充資料）。

面內(nèi)RMF和DMF相比，面外旋轉(zhuǎn)可以顯著提高MTB的滲透率(圖2C)。頻率在1到20赫茲之間的平面外驅(qū)動始終比沒有磁暴露的對照組產(chǎn)生更高的易位。鑒于這些發(fā)現(xiàn)，后續(xù)實驗都是使用平面外RMF進行的。

并且在每次實驗前后作者都進行了Lucifer yellow (LY)排斥試驗，驗證了MTB刺激不影響單層分子膜的完整性。在所有測試條件下，LY排斥值保持在99%以上，表明單層未發(fā)生損傷(圖2D)。

在觀察到使用RMF增強了MTB易位后，作者研究了使用RMF控制和MTB應答。與DMF或梯度場不同，RMF的時變性可同時用于MTB的驅(qū)動和監(jiān)測，使操作過程中可以調(diào)整驅(qū)動參數(shù)以改善位置。

在一個概念驗證實驗中，使用一個小型定制RMF磁強計驅(qū)動在過程中對MTB進行感應檢測，該磁強計由兩對嵌套Helmholtz線圈組成(圖2E)。正弦電流被應用到每組線圈產(chǎn)生一個圓形RMF。當暴露在RMF下時，MTB的總磁矩隨時間變化。MTB的磁化強度對于旋轉(zhuǎn)磁場是相移的，反映了細菌磁響應中的相位滯后。

使用擬合于同相場探針的余弦函數(shù)，我們將采集到的信號分離為樣品磁化率的同相分量和異相分量(圖2F)。將實驗數(shù)據(jù)與分析數(shù)據(jù)進行比較，以評估MTB產(chǎn)生的檢測信號是否符合預測特性。模型預測了同相和異相易感性的潛在趨勢，證實了能夠在RMF驅(qū)動下檢測MTB。

 

圖 RMF增強了MTB的易位，并能夠誘導檢測和空間選擇性控制MTB

 

用計算模型闡明轉(zhuǎn)矩驅(qū)動運動在易位中的作用

考慮到RMF對MTB通過細胞屏障傳輸?shù)娘@著影響，使用COMSOL Multiphysics中的計算模型來理解驅(qū)動增強易位的主要機制。由于內(nèi)皮是靜脈給藥后遇到的第一個生物屏障，因此對二維內(nèi)皮細胞單層運輸進行建模，該單層膜由相鄰的細胞組成，形成上下之間的密封屏障。流體動力的相互作用被模擬為作用在剛體上的線性阻尼和旋轉(zhuǎn)粘性阻尼。

對細菌通過被動連接所需的力進行建模，得到的接觸力進行估計(圖3A)。在低于12 mT，14 Hz旋轉(zhuǎn)的細菌，扭矩誘導接觸力遠低于細胞阻力(圖3B)和打破由血管內(nèi)皮-鈣粘蛋白鍵所需的力(36)。

為了表征模型單分子層的滲透性，模擬了直徑約200nm的脂質(zhì)體被動擴散，5.9%的脂質(zhì)體擴散到下腔室(圖3C)。繼續(xù)比較DMF和RMF下的MTB傳輸（圖3D）。在RMF條件下生成的細菌擴散速度顯示出良好的研究特性(圖3E)。

同時模型顯示，暴露于DMF的細菌中只有6.6%的細菌跨越了該屏障，而暴露于RMF的細菌有20%跨越了該屏障(圖3F)。相比之下，在RMF作用下的MTB沿著單層轉(zhuǎn)譯，這使得細菌能夠探索單層表面，并通過細胞之間的縫隙。這些發(fā)現(xiàn)表明，由基于扭矩的運動引起的表面探測是促進MTB易位增加的主要原因。

 

圖 MTB跨內(nèi)皮單層轉(zhuǎn)運的計算模型

 

RMF增加MTB-脂質(zhì)體結(jié)合物的外滲

繼續(xù)在適合于血管外滲模型的體外系統(tǒng)中研究易位。在Transwell植入物上培養(yǎng)的人單層微血管內(nèi)皮細胞(HMEC-1)用于模擬靜脈輸送后可能遇到的內(nèi)皮屏障。對VE-鈣粘蛋白進行了染色(圖4A)。從熒光強度可以發(fā)現(xiàn)，1小時后，只有0.24%的脂質(zhì)體能夠通過被動擴散進入基底外側(cè)腔(圖4B)。

然后研究MTB脂質(zhì)體的結(jié)合在單分子膜上的易位。MTB-LP復合物結(jié)合了傳統(tǒng)治療的納米載體適應性和磁性平臺功能性，生產(chǎn)了一種靶向給藥的微型機器人。增加個磁場強度下，MTB應變頻率為24 Hz(25)，與磁強計數(shù)據(jù)一致(圖2F)。

將MTB-LP在單分子膜的平面外激活1小時后，與暴露于DMF和未激活進行對照比較(圖4C)。平面外旋轉(zhuǎn)導致MTB-LP易位比DMF高4.6倍。暴露于DMF的MTB-LP濃度與非驅(qū)動對照相當，Caco-2單層實驗的情況也是如此（圖2C）。最后進行跨內(nèi)皮電阻（TEER）測量和LY排斥試驗，結(jié)果表明MTB激活不影響單層膜完整性（圖4D和E）。這表明在暴露于磁場后單層膜未發(fā)生破壞。

 

圖 基于RMF增加MTB-脂質(zhì)體結(jié)合物的外滲

 

基于RMF的控制改善MTB的轉(zhuǎn)運和三維球體腫瘤定植

證明了跨越內(nèi)皮單分子層的易位增強后，下一步在人乳腺腺癌(MCF-7)的球體外腫瘤模型實驗中測試基于RMF的控制對MTB-LP腫瘤滲透的影響。球狀腫瘤可以有效地再現(xiàn)無血管腫瘤組織的運輸特性和復雜結(jié)構(gòu)，并已被用于研究基于細菌的癌癥治療(42-44)。在1小時的驅(qū)動(MFG- 100-i, 20 mT和24 Hz)后，球體孵育120小時(圖5A)?？紤]到未驅(qū)動控制和DMF的結(jié)果具有可比性(圖2C和4C)，以及在球形三維模型中缺乏明確定義的優(yōu)先方向，在后續(xù)所有實驗中，將RMF與未驅(qū)動控制進行比較。

可視化培養(yǎng)24小時后脂質(zhì)體的分布(圖5B)。暴露于RMF后，MTB-LP結(jié)合物能夠推進到無血管球體的深部。在驅(qū)動樣品中檢測到密度隨著深度的增加而增加(圖5C)。

80 μm截面的強度分布曲線顯示，與對照組相比，驅(qū)動樣品中的MTB-LP分布存在明顯差異(圖5D)。對照樣組的熒光信號分布更為均勻。相比之下，驅(qū)動樣品的整體熒光強度值較高，且熒光信號在球體中心區(qū)域最高。在深度為100 μm的范圍內(nèi)，每個切片的平均熒光強度總和，是對照的4倍(圖5E)。

活體腫瘤的共聚焦圖像,被用于可視化和量化RMF樣本和未受刺激的對照組在24小時和120小時熒光標記細菌的分布(圖5F)。z投影圖像顯示，在120小時后，驅(qū)動樣品和對照組的MTB在球形內(nèi)仍然是可測量的。利用球體的熒光強度曲線來研究MTB在球體中的定位。MTB的優(yōu)先積累可能是由于氧敏感機制，這有利于它們向缺氧環(huán)境導航(47-49)。

每個切片在100μm深度內(nèi)的平均熒光強度總和,用于評估不同時間點球體中MTB的相對含量。在24小時和120小時，暴露于RMF的球體的熒光強度值分別是對照組的9.9倍和21.3倍。我們對MCF-7球狀體進行了組織學切片(圖5G)。從球體中心的切片顯示MTB在細胞之間形成簇狀，暴露于RMF的球體中MTB的信號高于對照組?？偟膩碚f，這些發(fā)現(xiàn)表明穩(wěn)定的腫瘤定植是磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動運動與自主導航結(jié)合的結(jié)果。

 

圖 基于RMF的控制改善MTB的轉(zhuǎn)運和三維球體腫瘤定植

 

基于RMF的控制增強了MTB在體內(nèi)腫瘤中的轉(zhuǎn)運

由于RMF對MTB體外轉(zhuǎn)運的顯著影響，下一步作者通過使用小鼠模型來測試RMF驅(qū)動方法是否也增強了體內(nèi)細菌的積累。BALB/c鼠后側(cè)皮下有MCF-7腫瘤，靜脈注射1×109 MTB,并將MTB染色為紅色(圖6A)。設置對照組，使一個定向磁場不能作用于腫瘤部位。

治療后，將小鼠放回籠中24小時，24小時后取出腫瘤和主要器官，利用全器官熒光掃描儀評估細菌的分布(圖6C)。所有腫瘤均檢測到熒光信號，說明細菌可以在腫瘤中天然積累。暴露于RMF的腫瘤小鼠比未受刺激的對照組高16倍(圖6D)。

為了評估在熒光掃描中檢測到的細菌是否仍然存活，采集的腫瘤被置于MTB培養(yǎng)基中。8天后，在所有的試管中都有大的黑色小球出現(xiàn)，表明腫瘤中含有活細菌(圖6E)。

對腫瘤進行組織學切片，在腫瘤深度約1mm處采集切片，和對照組相比交流組的腫瘤周圍有更明顯的聚集(圖6F)。腫瘤切片的分布隨著與周邊距離的增而增加，細菌可以在前250μm范圍內(nèi)被檢測到，暴露于RMF的樣品的信號總體高于對照組(圖6G)。同時評估橫向組織切片，評估MTB與腫瘤表面距離的分布(圖6H)。連續(xù)橫切面的熒光強度表明，總的熒光強度——MTB的傳遞量比對照組高2.1倍(圖6J)。這些結(jié)果，結(jié)合體外發(fā)現(xiàn)的分析，證明了磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動控制方法在增強腫瘤內(nèi)細菌的積累具有潛力。

圖 基于RMF的控制增強了MTB在體內(nèi)腫瘤中的轉(zhuǎn)運

 

四、討論

 

生物雜交微型機器人與不同的控制方法結(jié)合，具有增強腫瘤定植的潛力，增強了細菌治療癌癥的臨床可能。但這種方法有內(nèi)在的局限性，它降低了臨床轉(zhuǎn)化的潛力。相比之下，對于深部腫瘤中磁反應藥物的開環(huán)控制，在臨床上使用均勻的RMF的方法更加合理。

RMF的時變性為磁性微型機器人的實時驅(qū)動和檢測提供了機會。作者的概念驗證實驗證明了由RMF驅(qū)動的MTB可以被檢測到，并且它們基于力矩的運動可以被磁靜態(tài)門控場控制在一定區(qū)域內(nèi)。這些驗證為空間驅(qū)動、同步監(jiān)測和驅(qū)動閉環(huán)參數(shù)的進一步優(yōu)化奠定了基礎。

同時磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動自主導航被證明是一種非常有效的混合控制方法，可以幫助微型機器人跨越各種生物障礙。并且表明，開環(huán)控制方法在體外表征結(jié)果可以在體內(nèi)高度復雜的生物環(huán)境中復制，暴露于RMF的腫瘤可以獲得顯著的MTB積累。

將這種增強微生物微機器人滲透的方法與治療中藥物傳遞相結(jié)合，可能是提高細菌治療效果的有力工具，在細菌癌癥治療領域引起越來越多人的興趣。這種方法可以更有效地使用這些菌株，并且提高安全性和有效性。通過將細菌治療的優(yōu)點與可伸縮磁轉(zhuǎn)矩驅(qū)動控制方法結(jié)合，有效的針對活體微型機器人進行改進，未來可以用以癌癥治療。