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本篇將系統(tǒng)介紹流式細(xì)胞儀究竟是什么，它的檢測原理及關(guān)鍵組成部件。

 

一、流式細(xì)胞儀概述

 

（一）定義

 

流式細(xì)胞儀（流式細(xì)胞術(shù)）是利用激光作為光源產(chǎn)生散射光和熒光信號，并將這些信號由光電二極管或光電倍增管等檢測器讀取、轉(zhuǎn)換為電子信號、標(biāo)準(zhǔn)化格式 (fcs) 等數(shù)據(jù)文件輸出，從而對溶液中的單個細(xì)胞進(jìn)行快速篩選和分析或?qū)μ囟ǖ募?xì)胞亞群進(jìn)行分析并進(jìn)行分離純化的儀器。

 

 

圖 流式細(xì)胞儀簡圖1

 

用于流式細(xì)胞儀的樣本是單細(xì)胞懸液，可以是血液、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液、各種體液、新鮮實體瘤的單細(xì)胞懸液以及石蠟包埋組織的單細(xì)胞懸液等；

 

通過檢測可以對粒子進(jìn)行多參數(shù)分析，包括諸如粒子形狀、大小、細(xì)胞周期、多藥耐藥蛋白、細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子、細(xì)菌表面抗原、細(xì)胞DNA內(nèi)含物、多分子復(fù)合體排列等；

 

通過激光光源激發(fā)細(xì)胞上所標(biāo)記的熒光物質(zhì)的強(qiáng)度和顏色以及散射光的強(qiáng)度也可以得到細(xì)胞內(nèi)部各種各樣的生物信息；

 

此外還可以利用高分子熒光微球在流式細(xì)胞儀上做免疫和聚合酶鏈反應(yīng)等多種生物技術(shù)檢測；

 

流式細(xì)胞儀一般還有篩分的作用，可以根據(jù)所檢測細(xì)胞的某種性質(zhì)進(jìn)行分選，如果分選的過程是在無菌條件下進(jìn)行的，那么這些細(xì)胞還可以用來進(jìn)一步培養(yǎng)。2

 

（二）檢測原理

 

流式細(xì)胞儀的工作原理是使懸浮在液體中分散的經(jīng)熒光標(biāo)記的細(xì)胞或微粒逐個通過樣品池，同時由熒光探測器捕獲熒光信號并轉(zhuǎn)換成分別代表前向散射角、側(cè)向散射角和不同熒光強(qiáng)度的電脈沖信號（后文會詳細(xì)介紹），經(jīng)計算機(jī)處理形成相應(yīng)的點圖，直方圖和三維結(jié)構(gòu)圖像進(jìn)行分析（如圖）。

 

 

圖 流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)示意圖

 

在流式細(xì)胞儀中，溶液中的細(xì)胞以每秒10000個細(xì)胞（或更多）的速度通過儀器的激光束，進(jìn)而對細(xì)胞進(jìn)行檢測。如今的流式細(xì)胞儀具有更多的可檢測熒光參數(shù)（從1或2至最多30個左右或更多），可同時測量同一個細(xì)胞上的所有參數(shù)，其檢測速度快且具有單細(xì)胞水平檢測能力，可以為細(xì)胞生物學(xué)家在統(tǒng)計方面提供便利，快速分析和表征數(shù)百萬個細(xì)胞，但是流式細(xì)胞儀無法獲得顯微鏡可提供的形態(tài)特征和亞細(xì)胞定位，也造成了一些觀察上的不便，下表將流式細(xì)胞儀和顯微成像技術(shù)進(jìn)行比較。

 

表. 流式細(xì)胞術(shù)與顯微成像技術(shù)對比

 

 

（三）結(jié)構(gòu)組成3

 

流式細(xì)胞儀有3個主要組成部分，即液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)和電子系統(tǒng)，它們共同構(gòu)成了完整的細(xì)胞分析系統(tǒng)（圖）。

 

 

圖 流式細(xì)胞儀的工作元件

 

 

圖 流式細(xì)胞儀結(jié)構(gòu)簡圖

 

1、液流系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的液流系統(tǒng)包含鞘液（一種基于鹽的緩沖液或水），該鞘液被加壓通過機(jī)器，以引導(dǎo)細(xì)胞樣品通過激光，以便對每個單個細(xì)胞進(jìn)行單獨(dú)測量。

一般來講在樣品進(jìn)入流動池之前，細(xì)胞或微粒在流體懸浮液內(nèi)以隨機(jī)和無組織的方式移動（圖A），按照它們在圓柱形液體柱中的運(yùn)動來繪制相同大小細(xì)胞的分布圖發(fā)現(xiàn)，由于一些細(xì)胞將比正常情況移動得更快，另一些細(xì)胞會移動的更慢，因而其形狀將近似雙曲線（圖B）。

 

 

圖 流式細(xì)胞儀液流系統(tǒng)圖

 

此外，在任何給定時間，也不能保證細(xì)胞都單列移動。這會導(dǎo)致：(1)以不同速度行進(jìn)的細(xì)胞將引起數(shù)據(jù)波動 (2)彼此過于接近的細(xì)胞導(dǎo)致重合事件（兩個細(xì)胞被同時進(jìn)行分析，而非獨(dú)立地）的發(fā)生（圖左）。

 

 

圖 細(xì)胞重合事件的發(fā)生

 

流式細(xì)胞儀獲得的準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)依賴于能夠確保樣品中的所有微粒都被聚焦成單個細(xì)胞，并且它們在到達(dá)檢測點之前以相同的速度移動的流體系統(tǒng)。因此，流式細(xì)胞儀流體系統(tǒng)通過利用流體動力學(xué)來解決上述問題。也就是，系統(tǒng)使用液體（水）來強(qiáng)制細(xì)胞以相同的速度，并以單個細(xì)胞行進(jìn)。在流體動力學(xué)（圖右）中，使用較快移動的鞘液（鹽水）來迫使樣品進(jìn)入流體動力學(xué)核心，使得所有微粒沿同一軸線，以大致相同的速度行進(jìn)。

2、光學(xué)系統(tǒng)

光學(xué)系統(tǒng)的組件協(xié)同運(yùn)作，將不同波長的激光照射到細(xì)胞上，收集發(fā)射光子形式的數(shù)據(jù)（即側(cè)向和前向散射光以及激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)的發(fā)射光），并將這些光子轉(zhuǎn)換成電信號，導(dǎo)入電子系統(tǒng)。光學(xué)系統(tǒng)的元件包括激發(fā)光源、濾光片（用于引導(dǎo)光路）以及用于產(chǎn)生光電流的檢測系統(tǒng)。

⑴ 激發(fā)光源

細(xì)胞與激光發(fā)生相互作用的地方，稱為激光檢測點。在這里，細(xì)胞排成單列通過，而聚焦激發(fā)光穿過細(xì)胞流。在流式細(xì)胞儀中，最常見的激發(fā)光源稱為激光。激光具有一致性（具有同步、相同的波頻率）、單色性（具有單一波長）和高能性，這些特點可確保照射到細(xì)胞的光是具有特定波長的均一光線，常見激發(fā)光線如下表所示。

 

表 流式細(xì)胞術(shù)中的常見激光譜線

 

 

⑵ 共線與平行激光裝置4

在選擇實驗用的熒光基團(tuán)時，對激發(fā)光源的了解至關(guān)重要。一般這些光源的配置主要有兩種裝置：共線激光裝置和平行激光裝置（如圖）。共線激光裝置的激光器共用同一條光路，細(xì)胞同時被多個激光器激發(fā)。平行裝置中的激光器在空間上是分離的，細(xì)胞通過檢測點時，一次暴露于一個激發(fā)光源。不管是共線激光裝置還是平行激光裝置，兩個的裝置不是相互排斥的，因為一個儀器可以同時具有平行和共線激光裝置。

 

 

圖. 流式細(xì)胞儀的共線與平行激光裝置

 

所以在選擇用共線激光裝置和平行激光裝置時可根據(jù)熒光基團(tuán)的激發(fā)光（激發(fā)波長是用某種波長的光激發(fā)出熒光）和發(fā)射光（指某種光發(fā)射出來的熒光的波長）來判斷，例如當(dāng)兩種熒光基團(tuán)的發(fā)射波長相同但激發(fā)波長不同時可選擇平行激光裝置，當(dāng)發(fā)射波長不同激發(fā)波長相同時可選擇共線激光裝置。

⑶ 濾光片引導(dǎo)光路5

用于引導(dǎo)光路（光子）的發(fā)射濾光片有許多種，每組濾光片可將特定波長的光引導(dǎo)至與其相匹配的檢測器，如圖。

 

 

圖. 流式細(xì)胞儀中濾光片的位置

 

♦ 波通（LP）濾光片允許特定波長以上的所有光通過。圖A的實例是LP 500濾光片，表示波長在500nm以上的所有光均可通過濾光片。

♦ 短波通（SP）濾光片允許低于特定波長的所有光通過。圖B的實例是SP 500濾光片，表示只有波長低于500nm的光可以通過濾光片。

♦ 帶通（BP）濾光片可被認(rèn)為是LP和SP濾光片的交叉組合。只有特定波長范圍內(nèi)的光可以通過濾光片。圖C的實例是一個525/30 BP濾光片，表示只有波長/光在525 nm以下30nm內(nèi)可以通過濾光片，或者說是只有波長在495-555 nm范圍之間的光可以通過濾光片，其他所有光將被偏轉(zhuǎn)。

 

 

圖. 不同的濾光片

 

⑷ 檢測器6

檢測器捕獲由激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)和散射激光發(fā)射的光子將它們轉(zhuǎn)換成光電流，并傳遞到電子系統(tǒng)。流式細(xì)胞儀可使用多種類型的檢測器，最常見的類型是光電二極管和光電倍增管。

光電二極管：當(dāng)光子撞擊光電二極管時，它會將檢測器的原子離子化，在二極管的耗竭區(qū)域內(nèi)產(chǎn)生電子，并將其掃向正負(fù)電位，如圖。光電二極管價格便宜，但是靈敏度較低，它們對光電流的放大能力不如光電倍增管，通常用于負(fù)責(zé)處理最明亮的光或信號的通道，如前散射通道。

 

光電倍增管：當(dāng)光子進(jìn)入光電倍增管時，它們撞擊光電陰極并產(chǎn)生電子，這些電子從倍增電極移動到產(chǎn)生二次電子的倍增電極，使信號放大，如圖。光電倍增管對于低信號水平更敏感，可以使單個光子的能量放大數(shù)百萬倍，它們通常用于測量來自細(xì)胞的激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)的熒光以及側(cè)向散射信號。

 

 

圖. 流式細(xì)胞儀檢測器

 

3、電子系統(tǒng)

流式細(xì)胞儀的電子設(shè)備將檢測到的信號轉(zhuǎn)換為可以使用軟件進(jìn)行分析的數(shù)字參數(shù)的過程，具體如下：

1.當(dāng)細(xì)胞經(jīng)過檢測點，激光擊中細(xì)胞產(chǎn)生的光子可以被光電倍增器(PMD)或光電二極管探測到，這些光子可以來自細(xì)胞的散射或是細(xì)胞熒光物質(zhì)的熒光激發(fā)信號；

 

2.當(dāng)光子進(jìn)入探測器，光子被轉(zhuǎn)化為電子，信號被按比例增強(qiáng)。探測器以電流的形式輸出信號，此刻便是信號進(jìn)入電子系統(tǒng)的時間點，從圖中可以看到光子在電子系統(tǒng)中傳輸?shù)穆窂胶唸D；

 

3.電流信號從探測器輸出后進(jìn)入信號放大器，信號被放大并被轉(zhuǎn)換為電壓脈沖，脈沖繼而通過模數(shù)轉(zhuǎn)換器（ADC）被轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號；

 

4.數(shù)字信號被傳送到電腦存儲為數(shù)據(jù)以備分析。

 

 

圖. 光子在電子系統(tǒng)中的傳輸路徑

 

4、流式細(xì)胞儀的輸出7

流式細(xì)胞儀的三個主要輸出測量值是前向散射，側(cè)向散射和熒光信號，激光的可見光會反射出每個流通池，從而提供流通的尺寸和形狀特征。

前向散射（FSC）：是從正方向來的散射，沿著激光路徑每個單元將使光圍繞單元的側(cè)面彎曲，從而引起衍射而反射細(xì)胞的大小。FSC的強(qiáng)度反映了細(xì)胞的直徑，如圖。

 

 

圖. 前向散射

 

側(cè)面散射（SSC）：是指在90度激光束下測量的散射，細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)改變進(jìn)入細(xì)胞的光波方向，導(dǎo)致特定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)（例如顆粒和細(xì)胞核）折射光，反映了細(xì)胞的粒度或復(fù)雜性。SSC越強(qiáng)，折射越大，則預(yù)期單元中的粒度就越大。

 

 

圖. 側(cè)向散射

 

熒光信號：是激光激發(fā)熒光團(tuán)時發(fā)出的光。熒光團(tuán)是在激發(fā)時可以吸收并重新發(fā)射光的分子，來自激光源的光子被熒光團(tuán)的電子吸收，將其移動到更高的能量狀態(tài)。這些電子然后以光子的形式釋放能量以返回其基態(tài)。這些光子的波長受過程中分子相互作用損失的能量數(shù)量影響。每個熒光團(tuán)具有其自己的發(fā)射光譜，該發(fā)射光譜可以與其他熒光團(tuán)的發(fā)射光譜部分重疊。熒光團(tuán)可以用于標(biāo)記抗體，這些抗體又可以結(jié)合并因此檢測細(xì)胞上或細(xì)胞內(nèi)的特定抗原，或者可以用作染料直接染色細(xì)胞。

 

 

圖. 熒光信號

 

參考文獻(xiàn)：

 

[1]Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017;37(2):163-176. doi:10.3109/07388551.2015.1128876

[2]楊蕊, 鄒明強(qiáng). 流式細(xì)胞術(shù)的最新進(jìn)展[J]. 分析測試學(xué)報, 2004, 023(006):124-128.

[3]來源Thermo Fisher官網(wǎng)

[4]資料來源：Thermo Fisher 官網(wǎng)

[5]資料來源：Thermo Fisher

[6]資料來源：Thermo Fisher 官網(wǎng)

[7]Adan A, Alizada G, Kiraz Y, Baran Y, Nalbant A. Flow cytometry: basic principles and applications. Crit Rev Biotechnol. 2017;37(2):163-176. doi:10.3109/07388551.2015.1128876