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角膜是眼前部具有多層結(jié)構(gòu)的透明組織，本文通過數(shù)字光固化3D打印技術(shù)（DLP）制備了聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）/甲基丙烯酰化明膠（GelMA）水凝膠，其具有足夠力學(xué)性能、高透光率、高形狀保真度、適宜的溶脹度和降解速率以及優(yōu)異的細(xì)胞相容性，兔前板層角膜移植手術(shù)表明所構(gòu)建的負(fù)載細(xì)胞的仿生雙層水凝膠支架能夠促進(jìn)上皮愈合和基質(zhì)再生。

01 研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

角膜主要由五層結(jié)構(gòu)組成，從上到下分別為上皮層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮層，其對(duì)于折射、穿透光線具有重要作用，但由于燒傷、灼傷、外力損傷等原因，角膜疾病如今已經(jīng)是致盲的主要原因之一。雖然現(xiàn)有的人工角膜（如 AlphaCor和Boston）具有高度的透明性，可以在短期內(nèi)作為角膜替代物，但是由于其通常為不可降解以及生物惰性的材料，無法與自身組織相融合，因此舒適度差，美觀性低，長(zhǎng)期穿戴可能會(huì)對(duì)周圍組織造成損傷。近些年來，組織工程以及3D打印技術(shù)迅猛發(fā)展，為人工角膜的個(gè)性化制備提供了一種強(qiáng)有力的方法，同時(shí)3D打印可以制備具有不同結(jié)構(gòu)、不同尺寸參數(shù)、負(fù)載不同細(xì)胞的人工角膜，具有很大的發(fā)展前景。受此啟發(fā)，本文以PEGDA/GelMA為墨水，使用數(shù)字光固化打印技術(shù)制備水凝膠，并對(duì)其理化性質(zhì)、細(xì)胞相容性以及在體內(nèi)對(duì)角膜愈合的影響進(jìn)行表征（圖1）。

圖1.（A）PEGDA-GelMA水凝膠中墨水的成分和網(wǎng)絡(luò)形成的示意圖。（B）使用由含有rCECs的上皮層和含有rASCs的正交排列的纖維基質(zhì)層組成的雙層圓頂形角膜支架，描述了3D生物打印過程及其在兔角膜切除術(shù)模型中的應(yīng)用。

本文通過改變PEGDA的固含量制備了三種比例的水凝膠。在拉伸和壓縮測(cè)試中（圖2），PEGDA-GelMA-20-5水凝膠具有82.2 kPa的拉伸強(qiáng)度，77.2 kPa的拉伸模量和100.7 kPa的壓縮模量，能在保證手術(shù)操作的同時(shí)保留負(fù)載細(xì)胞的能力，壓縮模量接近于天然角膜的壓縮模量，有利于術(shù)后抵抗眼壓。此外，PEGDA的加入還提高了GelMA水凝膠的韌性和打印性能。

圖2.GelMA和PEGDA-GelMA水凝膠的機(jī)械性能。（答1）代表性拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線及其相應(yīng)的（A2）拉伸應(yīng)力，（A3）斷裂伸長(zhǎng)率和（A4）拉伸模量。（地下一）50%應(yīng)變、（B3）壓應(yīng)力和（B4）壓縮模量之前的代表性壓應(yīng)力-應(yīng)變曲線及其對(duì)應(yīng)的（B2）應(yīng)力-應(yīng)變曲線。（C）使用機(jī)械試驗(yàn)機(jī)對(duì)GelMA-5和PEGDA-GelMA-20-5水凝膠進(jìn)行壓縮處理。（D） 印刷的GelMA-5和PEGDA-GelMA-20-5水凝膠盤。

  如圖3所示，其他理化性質(zhì)測(cè)試表明此打印水凝膠能夠在1天內(nèi)達(dá)到溶脹平衡，一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)在膠原酶溶液中緩慢降解，并具有適宜的溶脹度和降解速率。透光率測(cè)試表明在600 nm處，水凝膠均能保持80 %以上的透光率，并大于天然兔角膜的透光率。流變測(cè)試結(jié)果顯示PEGDA-GelMA-20-5水凝膠具有3.1 kPa的儲(chǔ)能模量，與天然角膜相近。

圖3.PEGDA-GelMA水凝膠的表征。（A）水凝膠在37°C的PBS中孵育14天后的膨脹程度。 （B）在37°C的PBS中存在膠原酶（50U / mL）時(shí)水凝膠的降解曲線。 （C）水凝膠和天然角膜的光學(xué)透射率在400-800nm之間。（D） 顯示天然角膜、印刷角膜和印刷圓盤透明度的照片。 （E） 頻率范圍為 0.1 至 10 Hz 的水凝膠頻率掃描曲線。 （F） 根據(jù) （E） 計(jì)算的平均儲(chǔ)能模量 （G'） 和損耗模量 （G''）。

使用兔角膜上皮細(xì)胞測(cè)試水凝膠的細(xì)胞相容性（圖4），結(jié)果顯示水凝膠能夠支持細(xì)胞的遷移、黏附和增殖。將凝膠前驅(qū)液與細(xì)胞進(jìn)行混合并作為墨水進(jìn)行打印，7天后測(cè)試細(xì)胞存活率，仍能達(dá)到90%，并且凝膠的透光率也能達(dá)到88.9%。

圖4.PEGDA-GelMA-20-5水凝膠的體外細(xì)胞相容性。（A）2D劃痕測(cè)定中rCEC的代表性活/死圖像。（B）定量水凝膠和對(duì)照樣品中劃痕區(qū)域的相對(duì)細(xì)胞密度。（C）接種在PEGDA-GelMA-20-5水凝膠表面上的rCEC的代表性活/死圖像。（D）CCK-8細(xì)胞在水凝膠上的增殖結(jié)果。（E）生物打印后7天封裝在水凝膠中的rCEC的代表性活/死圖像。（F）在生物打印后1，3，5，7天，rCECs負(fù)載水凝膠在400-800nm之間的透明度變化。活/死圖像中的比例尺：300 μm。

為了考察墨水的可打印性，使用DLP打印機(jī)，對(duì)PEGDA-GelMA-20-5進(jìn)行不同模型的打印。如圖5所示，經(jīng)過逐層光固化，此墨水可以成功打印出兔子、皇冠、帶孔圓片，并具有足夠的強(qiáng)度和透明性。為了模擬角膜基質(zhì)層中正交的膠原纖維結(jié)構(gòu)，對(duì)水凝膠進(jìn)行正交結(jié)構(gòu)的打印，結(jié)果顯示水凝膠的打印精度較高，顯微鏡下的正交部分清晰可見，細(xì)胞分布均勻且具有較高活性。通過改變光吸收劑的濃度和曝光時(shí)間，本文還打印出了負(fù)載兔角膜上皮細(xì)胞的角膜結(jié)構(gòu)，其具有良好的光滑度和適宜的厚度、曲率，與天然角膜相似。

圖5.PEGDA-GelMA-20-5水凝膠的印刷性評(píng)估。（A1）打印兔子的3D模型和（A2）數(shù)碼照片。（地下一）印刷穿孔盤的數(shù)碼照片和（B2） 顯微照片。 （C1）3D模型和（C2）印刷冠的數(shù)碼照片。（C3）浸入PBS后的冠頂視圖和（C4）側(cè)視圖。（D1）3D模型，（D2）數(shù)碼照片和（D3）打印的正交排列纖維結(jié)構(gòu)的顯微照片。（D4）培養(yǎng)2天后評(píng)估正交排列的纖維物體中的live/死rCECs活力。（E）在細(xì)胞培養(yǎng)基中浸泡2天后印刷的水凝膠。印刷水凝膠 disc （F1） 帶和 （F2） 不帶光吸收劑。白色圓圈表示預(yù)定的打印區(qū)域。（G） 印刷角膜支架。比例尺：300 μm。

為了考察PEGDA-GelMA水凝膠在體內(nèi)對(duì)角膜愈合的影響，本文打印出負(fù)載兔角膜上皮細(xì)胞的上皮層以及負(fù)載兔脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的正交纖維基質(zhì)層，并進(jìn)行兔前板層角膜移植術(shù)將水凝膠移植入角膜損傷處。1個(gè)月的裂隙燈檢測(cè)（圖6）以及組織學(xué)染色（圖7）表明，水凝膠能夠加速上皮愈合和基質(zhì)再生，正交纖維結(jié)構(gòu)的存在和干細(xì)胞的雙重作用為角膜基質(zhì)細(xì)胞提供了最有效的再生環(huán)境。

圖6.ALK 兔模型中 3D 打印雙層角膜支架的體內(nèi)評(píng)估。 （A） 角膜移植術(shù)的外科手術(shù)，包括通過環(huán)鉆和刮刀去除角膜上皮基質(zhì)的某一部分、植入水凝膠和覆蓋縫合。（B）具有代表性的裂隙燈和鈷藍(lán)色照片，在不同時(shí)間點(diǎn)將水凝膠應(yīng)用于兔角膜后的體內(nèi)應(yīng)用。角膜上皮缺損（中央角膜綠色區(qū)域）大小的逐漸減小與上皮在水凝膠和缺損上的遷移有關(guān)。

圖7.在ALK的兔模型中應(yīng)用3D打印雙層角膜支架后進(jìn)行組織學(xué)和基因表達(dá)分析。 （A1）手術(shù)后1天用（A2）Col I和（A3）CK3抗體（綠色）對(duì)角膜進(jìn)行H&E染色和免疫染色。（地下一）手術(shù)后28天用（B2）Col I，（B3）CK3，（B4）LUM和（B5）SMA抗體（綠色）進(jìn)行H&E染色和免疫染色。紅色箭頭和矩形分別表示未完成的上皮和基質(zhì)區(qū)域。在所有圖像中，細(xì)胞核與DAPI（藍(lán)色）共染色。比例尺為200μm。從H&E圖像獲得的手術(shù)后28天角膜的（C1）總厚度，（C2）上皮和（C3）基質(zhì)層的厚度。（D1）KERA，（D2）ALDH，（D3）AQP1在角膜中的相對(duì)基因表達(dá)，在手術(shù)后28天通過PCR定量。該值反映了正常角膜上mRNA表達(dá)的倍數(shù)變化。

綜上所述，此3D打印仿生上皮/基質(zhì)雙層水凝膠具有與角膜相近的理化性質(zhì)，優(yōu)異的細(xì)胞相容性和體內(nèi)生物相容性，能夠加速角膜愈合，減少瘢痕的產(chǎn)生，具備應(yīng)用于角膜再生與修復(fù)中的潛力。