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TLC, HPLC, LCMS 是我們做項目時最常用的監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程的手段。“TLC 是化學(xué)家的眼睛”這句話我們再熟悉不過了。通常這三種監(jiān)測手段對于那些可以完全轉(zhuǎn)化且產(chǎn)物也是很穩(wěn)定的反應(yīng)來說是非常直接、而且高效的。但是事實上，我們做項目時經(jīng)常會碰到反應(yīng)不能完全轉(zhuǎn)化、產(chǎn)物不穩(wěn)定或者可以在同一體系下繼發(fā)反應(yīng)生成另外副產(chǎn)物的反應(yīng)。TLC，HPLC 和LCMS 都不能準(zhǔn)確描述反應(yīng)進(jìn)展。此情況下，如何定量監(jiān)測反應(yīng)轉(zhuǎn)化率及終止反應(yīng)時機(jī)將會至關(guān)重要。

我們都知道，HPLC/LCMS 所表征的是體系中各個化合物的紫外吸收峰面積比例。我們經(jīng)常是簡單的把此峰面積和物質(zhì)的含量畫了等號。事實上，如果體系中各物質(zhì)在某波長下的紫外吸收強(qiáng)度相差不大，這種算法還是具有參考價值的?？墒钱?dāng)體系中各物質(zhì)的紫外吸收強(qiáng)度相差很大時，HPLC/LCMS 將會嚴(yán)重誤導(dǎo)我們對反應(yīng)狀況的判斷。一個比較典型的例子如下：

上面這個反應(yīng)，原料有220nm 吸收但是沒有254nm 吸收。反應(yīng)完成后，碘顯色發(fā)現(xiàn)原料有少量剩余，同時生成另外一個很主要的點。但是LCMS（220nm）中只有原料原料（含量）90%）。但是我們也感覺很奇怪， TLC 有明顯的新點生成，沒有道理完全沒有反應(yīng)的。于是嘗試對新點進(jìn)行了柱分離，最終發(fā)現(xiàn)收率>80%。這個現(xiàn)象的主要問題就是原料和產(chǎn)物的紫外吸收強(qiáng)度相差過大導(dǎo)致的（差了2 個數(shù)量級）。當(dāng)然這是個極端的例子。但是類似的例子還有很多。以后再遇到類似問題時，我們不妨按照下面的方法嘗試一下，或許會起到事半功倍的效果。

1）要先通過小試（不在乎收率），拿到純的產(chǎn)物標(biāo)樣；

2）定量稱取等量的原料和產(chǎn)物（比如各20 mg）溶于常規(guī)溶劑比如（甲醇，水，DMSO）等，然后送HPLC 或者LCMS（要確保兩個峰都在含量-峰面積處于正常的線性范圍），根據(jù)HPLC/LCMS 的峰面積比值，即可確定原料和產(chǎn)物的紫外吸光度的比例情況；

3）反應(yīng)過程中，隨時監(jiān)測HPLC 或者LCMS，計算原料和產(chǎn)物的峰面積比例，再根據(jù)之前計算的原料產(chǎn)物吸光度即可準(zhǔn)確知道原料的轉(zhuǎn)化情況。

上述反應(yīng)是一個強(qiáng)酸催化的合環(huán)反應(yīng)。反應(yīng)轉(zhuǎn)化很難完全，并且產(chǎn)物在同一體系下穩(wěn)定性很差容易發(fā)生陽離子催化的聚合反應(yīng)。所以反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的監(jiān)測及反應(yīng)的及時終止非常重要?。ㄗⅲ貉娱L反應(yīng)時間，會導(dǎo)致產(chǎn)物的大量破壞，產(chǎn)率大幅下降，若反應(yīng)時間不夠，原料轉(zhuǎn)化率過低，也拿不到可接受的收率）

反應(yīng)轉(zhuǎn)化率的監(jiān)測：

1. 通過小試拿到產(chǎn)物標(biāo)樣；

2. 定量稱取原料/產(chǎn)物，通過HPLC 精確計算了兩者的吸光度比值（原料產(chǎn)物吸光度比6：1）；

3. HPLC 監(jiān)測反應(yīng)在峰面積1：1 時終止反應(yīng)，經(jīng)過柱純化之后收率大幅度提高，并且收率很穩(wěn)定。

該反應(yīng)原料難于完全轉(zhuǎn)化，隨著反應(yīng)的進(jìn)行， byproduct 逐漸增多（由product與還原中間體亞胺加成再還原得到的）。終產(chǎn)物的最終分離純化主要決定于byproduct的多少。所以如何控制原料1 的轉(zhuǎn)化率非常重要。

反應(yīng)轉(zhuǎn)化率監(jiān)測：

1. 根據(jù)計算，原料和產(chǎn)物吸光度比例為4：1

2. 根據(jù)HPLC，最終截止在原料產(chǎn)物峰面積比為1：2，此時byproduct 還很少（轉(zhuǎn)化率約為88%）此類方法可能需要慮紫外吸收強(qiáng)度的差別。