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01什么是反相柱、正相柱？

“反相”和“正相”的概念是液相色譜法早期提出的概念，當(dāng)時(shí)鍵合相色譜柱尚未出現(xiàn)，固定相被涂覆在載體表面，極易流失，為此科學(xué)家對流動相使用給出了合理的建議：流動相極性與固定液極性應(yīng)具有較大差別，以減少固定液流失。固定相極性弱于流動相時(shí)的液相色譜法被稱為反相色譜法，固定相極性強(qiáng)于流動相時(shí)的液相色譜法被稱為正相色譜法。盡管目前鍵合相色譜柱已成為主流，但這一概念在色譜方法開發(fā)、預(yù)測出峰順序等方面具有重要意義。

由上面的介紹可知具體的色譜方法、色譜柱屬于正相還是反相不僅取決于固定相極性，同時(shí)還取決于流動相極性。C18（硅膠鍵合十八烷基硅烷）、C8（硅膠鍵合辛基硅烷）、PH（硅膠鍵合苯基硅烷）等色譜柱，由于固定相極性極低，比目前已知的任何流動相的極性都要低，因而是標(biāo)準(zhǔn)的反相柱；

Silica（硅膠）、NH2（硅膠鍵合氨丙基硅烷）具有較高的極性，主要用于分離帶有極性基團(tuán)的化合物，所用流動相的極性通常低于這些固定相，因而是標(biāo)準(zhǔn)的正相柱。CN（硅膠鍵合腈丙基）的極性適中，當(dāng)流動相極性超過CN時(shí)，它屬于反相柱，反之則是正相柱。

02色譜柱規(guī)格對分析結(jié)果會產(chǎn)生何種影響？

色譜柱內(nèi)徑?jīng)Q定載樣量，載樣量與內(nèi)徑的平方成正比；色譜柱長度與塔板數(shù)成正比，與柱壓成正比；粒徑影響渦流擴(kuò)散相，粒徑越小渦流擴(kuò)散相越小，柱效越高，粒徑與柱效近似成反比；粒徑越小，壓力也越大，壓力與粒徑的平方成反比。填料孔徑對分析對象的分子量有限制，當(dāng)孔徑為分析物尺寸的5倍以上時(shí)，分析物才能順利通過孔隙，孔徑處于60~120 Å的色譜柱適用于相對分子量小于10000的分析物，孔徑為300 Å的色譜柱可以滿足分子量處于10000以上的大分子化合物分析。 

03液相色譜分析中如何才能提高分離度？

下式為分離度計(jì)算公式：

N：柱效(Efficiency)反映色譜柱性能，柱效越高，分離度越好。在其他條件恒定的情況下，塔板數(shù)增加一倍，分離度僅提高40%。操作中，可通過下面兩種方式增加塔板數(shù)進(jìn)而提高分離度：其一，使用長柱或雙柱串聯(lián)，但也會使分離時(shí)間大大延長；其二，使用細(xì)粒徑填料的色譜柱，但這需要耐更高壓力的液相色譜系統(tǒng)。相比之下后者更為可取。

α：選擇性(selectivity)是指色譜柱-流動相體系分離兩個(gè)化合物的能力。選擇性主要與固定相、流動相組成以及柱溫等因素有關(guān)，與保留值也密切相關(guān)，其中固定相和流動相組成影響較大。

以最常見的反相模式為例，反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用對化合物進(jìn)行保留的，不同化合物的分離是基于它們在鍵合相與流動相中分配系數(shù)的差異，如果兩種化合物的水溶性、在烷烴-水體系的分配系數(shù)等方面存在明顯差異，那么這些化合物通常是能夠利用反相柱達(dá)到分離；PH柱對具有苯環(huán)的化合物具有特殊保留。

正相模式下，硅膠柱、胺基柱、氰基柱與帶有極性基團(tuán)的化合物之間存在極性相互作用，對化合物的基團(tuán)具有選擇性，常常用于結(jié)構(gòu)類似物、異構(gòu)體化合物的分離。流動相方面，降低流動相的洗脫強(qiáng)度通?？梢栽龃蠓蛛x度；而有機(jī)溶劑類型也會影響分離，比如反相條件下，乙腈和甲醇的選擇性就存在很大差異，這種差異需要在實(shí)踐中摸索，但無論如何，多種溶劑類型帶給我們更多的實(shí)現(xiàn)分離的可能。

k：隨著容量因子k的增大，分離度也隨之增加，這種影響在k值較低時(shí)非常明顯，當(dāng)k值大于10時(shí)，k值增加對分離度的影響就不再顯著，這就告誡無原則地提高k值以增大分離度是沒有意義的。增加鍵合相密度能夠提高k值；另外改變鍵合基團(tuán)類型也能改變k值，比如在反相色譜中，隨著鍵合相碳鏈長度的增加，k值逐漸增大。

04何謂封端？封端的意義是什么？

、硅膠表面的硅羥基(Si-OH)密度為8 μmol/m2，由于空間位阻的存在，硅烷化鍵合反應(yīng)最多只能覆蓋50%的硅羥基，超過一半的硅羥基是活性硅羥基。這些硅羥基與化合物的極性基團(tuán)存在極性相互作用和離子交換作用，為化合物的保留增加了不被期望的作用力，往往會影響峰形。用短鏈氯硅烷（如三甲基氯硅烷）鍵合活性的硅羥基，可以減小甚至消除這種影響，這種操作被稱為封端(Endcap)。

封端處理的意義：

抑制了特異性吸附，提高了色譜峰的對稱性，并改善了分離效果；

在一定程度上掩蔽了硅膠表面，使其對堿性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)；

通過空間位阻掩蓋了鍵合反應(yīng)形成的Si-O-Si鍵，使其對酸性環(huán)境的耐受性增強(qiáng)；可能會影響對極性樣品的選擇性。

05柱床塌陷和鍵合相塌陷

柱床塌陷是指色譜柱使用一段時(shí)間后色譜柱入口處的柱床產(chǎn)生可見的空隙。該空隙的存在增大了死體積，會導(dǎo)致色譜柱柱效下降。造成柱床塌陷的原因如下：

其一，色譜柱填裝時(shí)的壓力過低，填裝不緊密，在高壓下使用一段時(shí)間，開始出現(xiàn)空隙；

其二，操作壓力超出色譜柱填料的耐壓值，導(dǎo)致填料顆粒破碎產(chǎn)生空隙；

其三，流動相溶解填料導(dǎo)致空隙出現(xiàn)。鍵合相塌陷是指由于流動相極性與鍵合相極性相差太大，鍵合相無法在流動相中充分伸展而倒伏、纏結(jié)在一起，比如普通C18在純水相條件下。相塌陷會導(dǎo)致色譜柱對化合物的保留不足。

06系統(tǒng)壓力升高的原因及排除

使用者通過觀察儀器的系統(tǒng)監(jiān)測掌握系統(tǒng)的壓力，如果發(fā)現(xiàn)壓力偏高，不要立即認(rèn)為“柱壓高了”，因?yàn)橄到y(tǒng)壓力通常由柱前壓力、色譜柱壓力和流通池壓力加合而成。此時(shí)正確的做法是：在操作條件下，測定系統(tǒng)壓力，得到p總；卸下色譜柱，在相同條件下，測定柱前壓力，得到p前；用兩通將泵流出管路與流通池連接，在操作條件下，測定壓力，得到p(前+后)。通過計(jì)算找出壓力高是來自柱前、色譜柱還是柱后。

以上情形假設(shè)沒有安裝保護(hù)柱，如果安裝了保護(hù)柱，壓力升高時(shí)應(yīng)先測試保護(hù)柱的壓力，以便確認(rèn)問題是否來自保護(hù)柱。

07柱性能下降

柱性能下降的一個(gè)重要現(xiàn)象就是在保留時(shí)間基本不發(fā)生變化的情況下，色譜峰的區(qū)域?qū)挾让黠@增大(如下圖)。

 當(dāng)遇到柱效下降，請按下表進(jìn)行排查和解決