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ADC已成為一類(lèi)很有前途的抗腫瘤藥物，目前已有十幾種ADC藥物獲得批準(zhǔn)，用于治療多種類(lèi)型的癌癥患者。傳統(tǒng)的 ADC 利用抗體賴(lài)氨酸的氨基或打開(kāi)鏈間二硫鍵獲得的半胱氨酸的巰基進(jìn)行偶聯(lián)，然而其均一性差，穩(wěn)定性低，影響了藥效及治療窗口。為了改進(jìn)這些問(wèn)題，研究人員開(kāi)發(fā)了各種特定部位的定點(diǎn)偶聯(lián)方法。這些方法將細(xì)胞毒素或化療藥物偶聯(lián)到抗體分子中特定的位置，例如半胱氨酸、谷氨酰胺、非天然氨基酸、短肽標(biāo)簽和多糖，從而制備均一度高，穩(wěn)定性好，具有更好的活性和藥代學(xué)特性的ADC。本文就四大類(lèi)經(jīng)典的定點(diǎn)偶聯(lián)技術(shù)在 ADC 中的應(yīng)用做一個(gè)簡(jiǎn)單介紹。

 

通過(guò)特定氨基酸實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)

 

幾種天然或工程改造的氨基酸，包括半胱氨酸和谷氨酰胺，被選作位點(diǎn)特異性的偶聯(lián)位點(diǎn)。

 

THIOMAB技術(shù)是第一個(gè)對(duì)天然氨基酸進(jìn)行修飾，將未配對(duì)的半胱氨酸進(jìn)行位點(diǎn)特異性的方法。該方法將半胱氨酸殘基插入抗體重鏈(HC)或輕鏈(LC)的不同位置進(jìn)行偶聯(lián)（圖1）。由于工程半胱氨酸在表達(dá)過(guò)程中易被谷胱甘肽或其他覆蓋，抗體需要部分還原以去除帽子。然后，使用硫醇-馬來(lái)酰亞胺化學(xué)方法，將未封端的半胱氨酸與含有硫醇連接子進(jìn)行反應(yīng)。研究表明通過(guò)半胱氨酸殘基(HC-A114C)的藥物連接子偶聯(lián)產(chǎn)生的ADC顯示出近乎均一的偶聯(lián)物，并且改善了治療指數(shù)。例如，抗MUC16 TDC（THIOMAB-drug conjugate）在小鼠卵巢癌移植瘤模型中的體內(nèi)效果比用傳統(tǒng)半胱氨酸法制備的ADC在同等藥物的劑量下藥效提高了一倍。大鼠和食蟹猴對(duì)TDC的耐受劑量也高于常規(guī)ADC。

 

 

圖1. THIOMAB技術(shù)產(chǎn)生的TDC

 

后續(xù)研究者開(kāi)發(fā)了將藥物連接子與抗體特定設(shè)計(jì)的半胱氨酸進(jìn)行定點(diǎn)偶聯(lián)的ADC。目前，多個(gè)位點(diǎn)特異性的ADC已進(jìn)入臨床，如SGN-CD19B、CD123A和CD352A（均為HC-S239C突變)；RG7861/DSTA4637S(LC-V205C突變)；IMGN632(S442C突變)；BAT8003(A114C突變)；以及基于雙半胱氨酸突變的ADC，如PF-06804103(LC-K183C HC-K290C)。還開(kāi)發(fā)了兩種其他的技術(shù)，即半胱氨酸插入，如MEDI2228(HC-i239C)；以及HC-末端多肽融合，如ALT-P7(C-末端ACGHAACGHA融合)。然而，半胱氨酸工程抗體的使用并不能保證臨床成功，一些已經(jīng)放棄開(kāi)發(fā)，例如，BAT8003和上面提到的Seagen的 三個(gè)ADC。

除了通過(guò)未配對(duì)的半胱氨酸偶聯(lián)外，還發(fā)展了硫醇橋聯(lián)方法。每個(gè)雙功能藥物連接子可以捕獲兩個(gè)游離的半胱氨酸硫醇基團(tuán)，從而在所有八個(gè)鏈間二硫鍵完全還原后導(dǎo)致DAR4 ADC，異質(zhì)性較低（圖2）。例如，New Bio 的 NBT828。

 

 

圖2. 雙馬來(lái)酰亞胺試劑交聯(lián)半胱氨酸

 

谷氨酰胺通過(guò)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)也被報(bào)道。該方法不使用還原和氧化試劑，而是利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(MTGase)將含胺的藥物連接子或反應(yīng)性spacer轉(zhuǎn)移到HC-Q295脫糖抗體中（圖3）。利用該技術(shù)的Innate ADC(IPH43)藥物目前處于臨床前階段。

 

 

圖3. 利用谷氨酰胺轉(zhuǎn)氨酶(mTG)將含胺的藥物連接子或反應(yīng)性spacer轉(zhuǎn)移到脫糖抗體中

 

通過(guò)非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)

 

藥物連接子與抗體中非天然氨基酸的偶聯(lián)是另一種新型定點(diǎn)偶聯(lián)產(chǎn)生勻質(zhì)性ADC的方法。目前引入的非天然氨基酸通常為乙酰苯丙氨酸（pAF）、疊氮基甲基-L-苯基丙氨酸(pAMF)和疊氮賴(lài)氨酸（圖4）。引入非天然氨基酸的抗體與藥物連接子可定點(diǎn)、定量偶聯(lián)，獲得 DAR 均一、藥效高、穩(wěn)定性好、安全性高的 ADC，但也存在抗體表達(dá)困難，易產(chǎn)生免疫原性的弊端。

 

 

圖4. 通過(guò)非天然氨基酸實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性ADC

 

Ambrx 公司的 ARX788 是首個(gè)利用非天然氨基酸開(kāi)發(fā)的抗體偶聯(lián)藥物，目前處于臨床研究階段。ARX788選擇的非天然氨基酸是乙酰苯丙氨酸（pAF），pAF上的酮基可與有效載荷AS269上的羥胺基團(tuán)形成肟鍵，發(fā)生特異性位點(diǎn)的偶聯(lián)，產(chǎn)生均質(zhì)的ADC。

 

Sutro Biophma開(kāi)發(fā)了一個(gè)無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)特定位置摻入p-疊氮甲基-L-苯丙氨酸(pAMF)，適合于隨后藥物連接子點(diǎn)擊化學(xué)的偶聯(lián)以此制備ADC。由于無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)的效率，進(jìn)行了位點(diǎn)掃描以確定最佳偶聯(lián)位置，目前已被用于各種ADC項(xiàng)目。例如， STRO-001（DAR2 ADC，HC-F404的偶聯(lián)）、STRO-002（DAR4 ADC， HC-Y180 和 HC-F404 中的偶聯(lián)）。

 

通過(guò)糖工程實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)

 

通過(guò)將藥物連接子與位于CH2結(jié)構(gòu)域的N297糖鏈偶聯(lián)，糖鏈介導(dǎo)的偶聯(lián)提供了一種獨(dú)特的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)方法。由于糖鏈的非還原末端存在幾種不同的單糖，人們開(kāi)發(fā)了不同的方法將藥物連接子連接到這些糖上，包括巖藻糖、半乳糖、N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和唾液酸(SA)。

 

Okeley等人報(bào)道了6-硫代果糖（一種巖藻糖類(lèi)似物）可以通過(guò)代謝偶聯(lián)到抗CD30或抗CD70抗體中。然后將抗體中的硫代果糖與含有MMAE藥物連接子的馬來(lái)酰亞胺偶聯(lián)，DAR為1.3。硫代果糖產(chǎn)生的ADC保持了良好的血漿穩(wěn)定性，并顯示出較強(qiáng)的抗腫瘤活性。

 

半乳糖或半乳糖類(lèi)似物也被通過(guò)半乳糖基轉(zhuǎn)移酶引入。菌株促進(jìn)的環(huán)炔與疊氮化物的環(huán)加成反應(yīng)已被用于GlycoConnect，這是Synaffix開(kāi)發(fā)的一項(xiàng)技術(shù)，其核心是將疊氮糖以酶促方式引入到天然抗體的多糖上?？贵w首先在UDP 6-疊氮基GalNAc存在下經(jīng)受內(nèi)切糖苷酶和糖基轉(zhuǎn)移酶(GalNAc-T) 兩種酶的作用，以便將天然糖轉(zhuǎn)化為均質(zhì)的、截?cái)嗟暮童B氮標(biāo)記的三糖(圖5)。接下來(lái)，對(duì)疊氮標(biāo)記的抗體進(jìn)行藥物連接子偶聯(lián)，以產(chǎn)生均一的ADC。GlycoConnectt技術(shù)目前被用于三個(gè)臨床ADC藥物：ADCT-601(ADC Therapeutics)、XMT-1592(Mersana Therapeutics)和MRG004A(Miracogen)。

 

 

圖5. UDP 6-疊氮基GalNAc存在下用內(nèi)切糖苷和GalNAc-T進(jìn)行多糖建模，通過(guò)連接有效載荷的無(wú)金屬點(diǎn)擊偶聯(lián)獲得均一的ADC

 

此外，也開(kāi)發(fā)了利用唾液酸(SA)進(jìn)行了位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的方法。SA首先被轉(zhuǎn)移到抗體上，然后用高碘酸氧化以連接到含氨氧基的藥物連接子（圖6）。用此方法制備的抗HER2 ADC具有較強(qiáng)的體外和體內(nèi)抗腫瘤活性。另一種類(lèi)似的方法是通過(guò)無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)將C9-疊氮化SA轉(zhuǎn)移到到抗體上，然后與含有細(xì)胞毒素的DBCO偶聯(lián)。

 

 

圖6. 利用唾液酸(SA)進(jìn)行的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)反應(yīng)

 

糖工程方法的獨(dú)特之處在于，藥物連接子與糖鏈偶聯(lián)，而不需要設(shè)計(jì)氨基酸序列，并且它們連接在遠(yuǎn)離氨基酸殘基的地方。然而，該方法需要糖工程所需的特殊試劑和酶。

 

通過(guò)短肽標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)位點(diǎn)特異性偶聯(lián)

 

目前開(kāi)發(fā)了一些通過(guò)將細(xì)胞毒素與含有四到六個(gè)氨基酸殘基的特定短肽標(biāo)簽偶聯(lián)的位點(diǎn)特異性偶聯(lián)方法。

 

Strop等人的研究將谷氨酰胺標(biāo)簽(LLQG)設(shè)計(jì)成抗體分子，標(biāo)簽中的谷氨酰胺可以被MTG識(shí)別以轉(zhuǎn)移含胺藥物。該研究證明，藥物連接子MMAD可以通過(guò)酶有效地轉(zhuǎn)移到谷氨酰胺標(biāo)簽上，包括C端重鏈上的LLQGA或C端輕鏈上的GGLLQGA。該ADC具有均一性的 DAR 2，展現(xiàn)了強(qiáng)效的抗腫瘤活性。

 

另一項(xiàng)研究通過(guò)使用轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，產(chǎn)生位點(diǎn)特異性偶聯(lián)的ADC。轉(zhuǎn)肽酶的主要功能是幫助蛋白質(zhì)附著到細(xì)菌細(xì)胞壁上，并組裝菌毛。轉(zhuǎn)肽酶作用于含有 C 端細(xì)胞壁分選信號(hào)的分泌蛋白，該信號(hào)含有一個(gè)五殘基識(shí)別基序，例如 LPXTG，可以與特定的寡甘氨酸受體底物發(fā)生酰胺化反應(yīng) ，從而用受體的寡甘氨酸片段取代LPXTG的末端甘氨酸。這個(gè)方法已經(jīng)用于產(chǎn)生ADC(圖7)。例如，NBE Therapeutics公司利用這一方法，通過(guò)將LPETG標(biāo)簽融合到重鏈C-末端，然后與五甘氨酸修飾的細(xì)胞毒有效載荷PNU-159,682連接，開(kāi)發(fā)了已經(jīng)進(jìn)入臨床的ADCs 藥物NBE-002。同樣，GeneQuantum開(kāi)發(fā)了基于重鏈 C 端 LPGTG 的GQ-1001藥物。

 

 

圖7. 轉(zhuǎn)肽酶介導(dǎo)的Gly5-Linker有效載荷與C端LPXTG標(biāo)記抗體的偶聯(lián)

 

這類(lèi)方法依賴(lài)于將獨(dú)特的短肽標(biāo)簽引入抗體中進(jìn)行酶修飾。雖然這類(lèi)方法很簡(jiǎn)單，但這些短肽標(biāo)簽的潛在免疫原性目前尚不清楚，需要后續(xù)更多的臨床驗(yàn)證。

 

小編小結(jié)

 

通過(guò)將細(xì)胞毒素或化療藥物與工程特定的氨基酸、非天然氨基酸、短肽標(biāo)簽和N297多糖偶聯(lián)，研究人員開(kāi)發(fā)了下一代位點(diǎn)特異性偶聯(lián)技術(shù)。這些方法產(chǎn)生的ADC具有高度均一性，保證了生產(chǎn)過(guò)程批次間的重現(xiàn)性，與傳統(tǒng)的偶聯(lián)物相比具有更高的治療指數(shù)。毫無(wú)疑問(wèn)，這些新型技術(shù)未來(lái)將會(huì)為ADC藥物更多的突破和成功發(fā)揮重要作用。

 

參考文獻(xiàn)

 

1.Site-Specific Antibody Conjugation for ADC and Beyond.

2.Chemical Linkers in Antibody–Drug Conjugates (ADCs).

3.Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.

4.Site-Specific Antibody−Drug Conjugation through Glycoengineering.

5.Site-specific conjugation of a cytotoxic drug to an antibody improves the therapeutic index.

6.Enzymatic Antibody Modification by Bacterial Transglutaminase.

7.Transglutaminase-Based Chemo-Enzymatic Conjugation Approach Yields Homogeneous Antibody−Drug Conjugates

8.凱萊英藥聞公眾號(hào)