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本文主要介紹了廈門致善生物科技股份有限公司研發(fā)的醫(yī)療器械“分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）”的臨床前研發(fā)實驗。

一、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）產(chǎn)品的主要組成成分 

本試劑盒含有分枝桿菌PCR反應管、分枝桿菌陽性對照、分枝桿菌陰性對照、PCR八聯(lián)管管蓋，主要組成成分見表1。

表 1 試劑盒主要組成成分

二、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的產(chǎn)品預期用途 

本產(chǎn)品用于體外定性檢測分枝桿菌培養(yǎng)物樣本中的19種分枝桿菌核酸，包括：結核分枝桿菌（復合群）、恥垢分枝桿菌、牛分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海分枝桿菌或潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌。

本產(chǎn)品適用于臨床上分枝桿菌感染的輔助診斷。 

三、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的產(chǎn)品包裝規(guī)格

48測試/盒。 

四、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的產(chǎn)品檢驗原理

本試劑盒采用熒光 PCR 熔解曲線法，根據(jù)不同分枝桿菌ITS片段的特異序列設計探針，采用特定的熒光通道和熔點進行分枝桿菌的鑒別。同時在體系中加入外源性內(nèi)控模板（擬南芥管家基因SUC2作為參照基因），對擴增體系進行質量控制。

五、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的主要原材料

本產(chǎn)品主要原材料包括：引物、探針、聚合酶、UNG酶、dNTPs、質粒原料等。主要原材料聚合酶和質粒原料為自產(chǎn)，其他原材料均為外購。引物、探針為申請人自行設計后由專業(yè)合成公司合成。申請人選擇有資質的供應商提供的原料，通過功能性試驗，篩選出最佳原材料和供應商，制定了各主要原材料的質量標準并經(jīng)檢驗合格。 

企業(yè)參考品設置情況：申請人設計了完整的企業(yè)參考品，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測限參考品和重復性參考品等，均采用真實樣本滅活后制備而成。陽性參考品來源于30份檢測范圍內(nèi)分枝桿菌樣本制備而成，陰性參考品來源于25份檢測范圍外分枝桿菌樣本或不含分枝桿菌樣本制備而成，檢測限參考品來源于5份檢測范圍內(nèi)分枝桿菌樣本制備而成，重復性參考品來源于5份檢測范圍內(nèi)分枝桿菌樣本制備而成。

申請人通過對試劑主要生產(chǎn)工藝的研究，確定了最佳生產(chǎn)工藝。申請人對反應體系中引物、探針、聚合酶、UNG酶和dNTPs等的濃度和用量進行了優(yōu)化，并對反應體系的擴增程序、退火溫度、退火時間、擴增循環(huán)數(shù)、樣本用量等進行了優(yōu)化和驗證，此外對樣本核酸的提取方法和取樣量進行了驗證，通過驗證最終確定了最佳反應體系。 

七、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的分析性能評估研究

該產(chǎn)品分析性能主要包括：核酸提取性能、陰陽性符合率、精密度、最低檢測限、特異性（交叉反應、干擾試驗）、包容性研究等。申請人提交了有效運行的質量管理體系下生產(chǎn)的不少于三批的產(chǎn)品在適用機型SLAN-96S全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)上的性能評估資料。

在核酸提取性能研究中，比較評估了產(chǎn)品配套使用的核酸提取試劑盒的提取效果，結果表明配套使用的核酸提取試劑盒的核酸提取性能滿足產(chǎn)品使用需求。

在陰陽性符合率研究中，申請人采用不少于三批的成品試劑盒，檢測企業(yè)陽性參考品、陰性參考品和臨床樣本。結果表明陽性符合率和陰性符合率均為100%。

在精密度研究中，申請人采用不少于三批的成品試劑盒，對兩種不同濃度的 19 份陽性樣本和 4 份陰性樣本，進行了多天的精密度研究，評估了試劑盒批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同操作者之間等的精密度。結果表明：試劑盒批內(nèi)/批間、日內(nèi)/日間、不同操作者之間的精密度均符合要求。

在最低檢測限研究中，申請人采用不少于三批的成品試劑盒，檢測19種分枝桿菌的系列濃度梯度樣本，將達到100%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的最低檢測限，并進行最低檢測限驗證。最終確定該產(chǎn)品最低檢測限為 103菌/mL。

在交叉反應研究中，申請人采用不少于三批的成品試劑盒，進行了近源菌及不在試劑盒檢測范圍中的呼吸道感染相關病原體等的交叉反應。結果表明：本試劑盒與亞洲分枝桿菌、胃分枝桿菌、施氏分枝桿菌、次要分枝桿菌、產(chǎn)鼻疽分枝桿菌、草分枝桿菌、抗熱分枝桿菌、金色分枝桿菌、微黃分枝桿菌、淺黃分枝桿菌、科莫斯分枝桿菌、新金色分枝桿菌、副偶然分枝桿菌、豬分枝桿菌、灰塵分枝桿菌、塞內(nèi)加爾分枝桿菌、田野分枝桿菌、南非分枝桿菌、迪氏分枝桿菌、母牛分枝桿菌、肺炎球菌、嗜肺軍團菌、百日咳博德特氏菌、巴西諾卡氏菌、北京棒桿菌、流感嗜血桿菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、隱球菌、綠膿桿菌、白色念珠菌、人流感病毒A型、人流感病毒B型、人副流感病毒1型、人副流感病毒2型、人副流感病毒3型無交叉反應。

在干擾試驗研究中，申請人采用不少于三批的成品試劑盒，對樣本中可能含有的干擾物質進行了研究，包括常見的外源干擾物質利福平（9 mg/L）、異煙肼（12 mg/L）、乙胺丁醇（8 mg/L）、吡嗪酰胺（45 mg/L）、卡那霉素（30 mg/L）、鏈霉素（50 mg/L）、阿莫西林（11 mg/L）、扎那米韋（0.5 mg/L）、腎上腺素（1 mg/L）、地塞米松（20 mg/L）、莫匹羅星（20 mg/L）藥物等，結果顯示相應干擾物質不會對產(chǎn)品的檢測結果產(chǎn)生干擾。

在包容性研究中，申請人采用三批成品試劑盒，對標準菌株及收集于不同地區(qū)的不同來源的各目標菌的陽性樣本進行檢測。包括：結核分枝桿菌（含 H37RV 菌株）、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌、牛分枝桿菌（含 ATCC35743 菌株和 BCG 菌株）、恥垢分枝桿菌、瘰疬分枝桿菌、龜分枝桿菌、猿猴分枝桿菌、緩黃分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、偶然分枝桿菌、海分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、土地分枝桿菌、不產(chǎn)色分枝桿菌、蘇加分枝桿菌、馬爾摩分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和鳥分枝桿菌。檢測結果表明，本試劑檢測不同地區(qū)收集的上述不同種類分枝桿菌均能檢出。

八、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的陽性判斷值研究

申請人采用該產(chǎn)品和配套儀器對收集的臨床樣本進行檢測，獲得原始的 Tm 值，通過對相應樣本的數(shù)據(jù)分布進行統(tǒng)計分析并計算標準偏差制定各指標的參考區(qū)間。采用多例樣本進行參考區(qū)間的驗證，根據(jù)驗證結果最終確定了試劑盒的參考區(qū)間。

九、分枝桿菌鑒定試劑盒（熒光PCR熔解曲線法）的穩(wěn)定性研究

申請人對本產(chǎn)品的實時穩(wěn)定性、開封穩(wěn)定性、凍融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性以及樣本穩(wěn)定性等進行了系統(tǒng)的研究，確定了在各種條件下本產(chǎn)品及樣本的有效保存時間。

實時穩(wěn)定性：試劑盒分別儲存于 2～8℃和-20±5℃溫度下，在不同時間點對試劑盒的外觀、最低檢測限、特異性和精密度等性能進行考察。結果表明試劑盒在-25～8℃避光保存，有效期 18 個月。