生產(chǎn)具有一致質(zhì)量的重組腺相關病毒 (rAAV) 的上、下游工藝的優(yōu)化取決于快速表征關鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 的能力。在 rAAV 生產(chǎn)的背景下，病毒滴度、衣殼含量和聚體被確定為潛在的 CQA，影響 rAAV 介導的基因治療產(chǎn)品的效力、純度和安全性。盡管快速、高通量的方法開始被開發(fā)和商業(yè)化，檢測這些屬性的分析方法通常會因工藝開發(fā)的周轉時間長或產(chǎn)量低而受到影響。這些方法尚未在學術或工業(yè)實踐中得到很好的確立，支持性數(shù)據(jù)也很少。在這里，我們回顧了已建立和即將推出的 rAAV 質(zhì)量屬性定量檢測分析方法。在評估每種方法時，我們強調(diào) rAAV 快速在線表征的進展。此外，我們發(fā)現(xiàn)從傳統(tǒng)方法過渡到新方法的一個關鍵挑戰(zhàn)是后者缺乏學術和工業(yè)經(jīng)驗。這篇文獻綜述可作為選擇針對質(zhì)量屬性的分析方法的指南，以在rAAV 介導的基因療法的工藝開發(fā)過程中進行快速、高通量的過程表征。
重組腺相關病毒 (rAAV) 被廣泛用作體內(nèi)基因治療的載體，主要是因為它們對人類無致病性、低免疫原性和長期基因表達。美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 已經(jīng)批準了兩種基于 rAAV 的基因療法，用于治療罕見的單基因疾?。杭顾栊约∥s癥 (Zolgensma) 和 Leber 先天性黑蒙 (Luxturna)。此外，基于 rAAV 的基因療法目前正在 200 多項臨床試驗中進行研究，用于治療從腫瘤到神經(jīng)系統(tǒng)疾病的一系列疾病。隨著rAAV 的臨床潛力得到認可，在不影響效力、純度和安全性的情況下規(guī)模放大其生物生產(chǎn)過程的挑戰(zhàn)變得越來越受重視。
生物藥生產(chǎn)平臺的開發(fā)需要識別產(chǎn)品的關鍵質(zhì)量屬性 (CQA) 并表征 CQA 與工藝參數(shù)之間的功能關系。CQA 被定義為“一種物理、化學、生物或微生物特性或特點，其應處于適當?shù)南薅?、范圍或分布?nèi)，以確保所需的產(chǎn)品質(zhì)量”，CQA 是一種屬性 - 廣泛對應于產(chǎn)品的特性、效力、純度或安全性 - 如果超出其目標范圍，將對產(chǎn)品質(zhì)量和功效產(chǎn)生嚴重影響。工藝參數(shù)變化對這些 CQA 的影響的表征，例如通過使用實驗設計，提高了對工藝的理解，使其得以優(yōu)化，并最終通過設計確保產(chǎn)品質(zhì)量（表 1）。對于生物藥，如 rAAV，藥物底物的屬性（例如，一致性）和雜質(zhì)知識 - 無論是與產(chǎn)品相關的（例如，非活性產(chǎn)品異構體和聚體）還是與工藝相關的（例如，宿主細胞蛋白或 DNA） - 幫助在開發(fā)早期識別CQA。盡管與工藝相關的屬性并不是 rAAV 生產(chǎn)所獨有的，但與 rAAV 產(chǎn)品或產(chǎn)品相關雜質(zhì)有關的 CQA 才剛剛開始被明確識別。在這篇綜述中，我們重點關注 rAAV 生產(chǎn)的生產(chǎn)力、病毒滴度、具有完整基因組的衣殼的比例（含量比）以及聚集衣殼的數(shù)量，基于它們對產(chǎn)品安全性和功效的影響而可作為潛在的CQA。
表1. 與工藝開發(fā)相關的重要術語的定義
rAAV的質(zhì)量屬性通常使用耗時的質(zhì)量控制檢測進行分析，以對最終產(chǎn)品進行批次放行測試，確保它們符合安全使用的監(jiān)管規(guī)范。然而，此類產(chǎn)品開發(fā)時間短，需要具有快速周轉和高通量的經(jīng)濟分析方法。例如，用于早期篩選 rAAV 生產(chǎn)平臺的部分因子設計（三個級別的五個工藝參數(shù)）需要對實驗進行快速、高度并行的分析。這種通量不可避免地會導致大多數(shù)已建立的質(zhì)量控制分析的分析能力出現(xiàn)瓶頸。或者，快速、高通量的分析方法可以迅速產(chǎn)生可操作的結果，促進對過程的理解并加快開發(fā)決策。然而，有限的樣品數(shù)量和基質(zhì)效應（例如，緩沖液特性、殘留 DNA 或蛋白質(zhì)以及離子強度）對工藝開發(fā)中的此類方法提出了挑戰(zhàn)。通常，實驗室規(guī)模的生產(chǎn)僅可獲得幾毫升 (mL) 的純化 rAAV - 相當于1012-1014 載體基因組 (vg) - 因此分析所需的樣本量可能會導致產(chǎn)品的顯著損失。同時，樣品中的病毒濃度涵蓋多個數(shù)量級，從粗培養(yǎng)收獲液的 1010 - 1011 vg/mL 到純化產(chǎn)物中的 1013 - 1014 vg/mL，并且樣品基質(zhì)變化很大，在最初的下游步驟中，殘留的副產(chǎn)物、宿主細胞蛋白和 DNA的質(zhì)量濃度比 rAAV 高 10 - 100 倍。這種過量的殘留副產(chǎn)物限制了特異性不足的方法的適用性，除非進行了大量的樣品純化工作。
在本文中，我們首先介紹基因組和衣殼滴度、含量比率和聚體含量這三個質(zhì)量屬性，用于表征 rAAV 中產(chǎn)生的主要衣殼類型（圖 1）。為了將這些質(zhì)量屬性確定為 CQA，我們將概述它們在常見生產(chǎn)過程中的可變性以及它們對 rAAV 產(chǎn)品安全性和有效性的一般影響。然后，我們在工藝開發(fā)的背景下討論它們作為 CQA 的優(yōu)點和缺點。最后，我們將介紹當前最先進的、用于表征 rAAVCQA的分析方法，并為進一步的方法開發(fā)提出建議。
rAAV的產(chǎn)品相關CQA
作為第一個潛在的 CQA，病毒滴度或濃度是指感染性、基因組或衣殼滴度（圖 2）。在這里，我們將關注基因組和衣殼滴度，因為從工藝開發(fā)的角度來看，它們實際上是可測量的?；蚪M滴度代表包含載體基因組（即病毒體）的衣殼，估計樣品的效力，被主要用于 rAAV 臨床給藥劑量的確定。相反，衣殼滴度代表所有衣殼，與包含的基因組無關?？傄職さ亩繉τ谙掠位厥栈蚣兓に嚨牟僮骱蛢?yōu)化至關重要，這些工藝取決于產(chǎn)品的上樣而不是其效力，例如，制備型層析柱的上樣，或柱餾分的合并。此外，衣殼往往會聚集，這取決于它們的總濃度和環(huán)境條件，例如溫度、離子強度和 pH 值。因此，根據(jù)所考慮的工藝單元，基因組和衣殼滴度都可以指示產(chǎn)品的效力、安全性和功效。相比之下，感染性滴度（一種體外生物活性的量度）需要 1-3 天才能量化，并表現(xiàn)出多個數(shù)量級的可變性；因此，及時表征產(chǎn)品效力是不切實際的。其定量方法基于端點稀釋測定、感染中心測定和轉基因表達測定，這些方法將不在本文中進行討論。
含量比，作為第二個潛在的 CQA，是指病毒衣殼缺失或具有部分基因組的比例，分別稱為空衣殼或部分包裹衣殼，代表rAAV 生產(chǎn)中最常見的產(chǎn)品相關雜質(zhì)（圖 1）。不同的因素，例如載體基因組的長度和類型（即單鏈或自互補），會導致沒有預期載體基因組的衣殼總比例的差異性。此外，生產(chǎn)平臺的選擇和質(zhì)粒的大小會影響非轉基因序列的反向包裹，導致不同程度地產(chǎn)生部分包裹 DNA 雜質(zhì)的不希望的衣殼亞群。空衣殼，以及帶有非轉基因序列的衣殼，可以引發(fā)不必要的免疫反應并競爭載體結合位點，增加免疫毒性的風險并降低完整衣殼的轉導率，這是產(chǎn)品功效所必需的。完整衣殼與所有衣殼的比率，稱為含量比，在收獲時的生產(chǎn)培養(yǎng)物中可以從 <1% 到 30% 不等，并且在不同批次的生產(chǎn)運行之間不一致（圖 1）。含量比影響工藝效率和產(chǎn)品純度，最近已將含量比添加到基于病毒的基因療法的監(jiān)管產(chǎn)品規(guī)范中，并且是工藝開發(fā)中的一個重要質(zhì)量屬性。與空衣殼不同，部分包裹的衣殼和帶有宿主細胞/質(zhì)粒 DNA 的完整衣殼可能具有額外的基因毒性作用，具體取決于包裹的基因組的類型。除了空的和部分包裹的衣殼外，其它雜質(zhì)也可能導致免疫或基因毒性作用，例如殘留的輔助病毒（來自上游轉導步驟）、殘留的蛋白質(zhì)（來自宿主細胞或細胞培養(yǎng)基），或核酸（宿主細胞 DNA/RNA）。
作為第三個潛在 CQA 的衣殼聚體代表了另一種與產(chǎn)品相關的雜質(zhì)，對載體產(chǎn)品的安全性和長期穩(wěn)定性產(chǎn)生不利影響，因為即使是痕量水平（例如，<1%）也為進一步聚集提供了成核位點。rAAV 制劑中存在小的低聚物（d < 100 nm）和大的、亞可見聚集體（d > 100 nm），并且樣品基質(zhì)中的高濃度衣殼、殘留核酸或低離子強度被證明有助于rAAV2 的聚集。因此，聚集可能發(fā)生在下游工藝中存在這些條件的多個節(jié)點，例如，在濃縮步驟期間或作為緩沖液置換的結果。為確保產(chǎn)品安全，需要盡量減少聚集程度并確定影響該產(chǎn)品屬性的工藝條件。
圖 1. rAAV 生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的主要衣殼類型概述：所有衣殼的比例結果包括在收獲時rAAV 生產(chǎn)培養(yǎng)液（“收獲液”），例如，在任何純化之前的細胞裂解液中，以及在產(chǎn)品中純化后（“純化液”）中，即在從細胞裂解液中純化完整衣殼之后，但在將完整衣殼與空衣殼幾乎完全分離的任何精純步驟之前。數(shù)據(jù)基于報告的大規(guī)模 rAAV 生產(chǎn)的文獻。根據(jù)大?。ǘ嗑垠w，d < 100 nm）或大（d > 100 nm）來識別聚體，其含量與商業(yè)純化的 rAAV 產(chǎn)品相同。
圖 2. rAAV 樣品的傳染性、基因組和衣殼滴度之間的差異：生產(chǎn)過程中滴度的常見范圍以其常用單位給出，基于報告的大規(guī)模 rAAV生產(chǎn)的文獻。
分析方法在質(zhì)量屬性表征中的表現(xiàn)
分析方法必須具備一系列特性，以證明其適用于其預期目的（即方法確認和驗證），以及滿足工藝開發(fā)中的特定需求（表 3）。對于后者，這些特性還可能包括適用于近線（at-line）或入線（in-line）應用。與需要將樣品從采樣點移至實驗室環(huán)境的離線（off-line）分析相比，能夠近線或入線應用的方法有助于使用靠近采樣點（近線）或直接集成到工藝本身（入線）。工藝開發(fā)中使用的方法不要求基于分析程序驗證監(jiān)管指南中定義的特征對分析方法進行確認和驗證。盡管如此，這些特征中的大多數(shù)，例如準確度、精確度和特異性，仍然適用，因為通常在開發(fā)的早期階段使用這些特征來對檢測進行確認。對于后期開發(fā)階段以及認證生產(chǎn)所使用的分析，需要基于監(jiān)管指南進行全面分析驗證，而不僅是質(zhì)量確認。表 4 總結了本綜述中討論的分析方法的上述特征，表 5 列出了關鍵結論。
表3. 與方法確認、驗證和工藝開發(fā)需求相關的分析方法的特征
表4. 本文討論的分析方法的最重要性能標準的數(shù)據(jù)
表5. 每種分析方法的主要優(yōu)點和缺點
原文：A.L.Gimpel, G.Katsikis, S.Sha, et al., Analytical methods for process and product characterization of recombinant adeno-associated virus-based gene therapies. Molecular Therapy: Methods & Clinical Developmen, 2021, 20.
參考資料
【1】《基因治療研發(fā)和生產(chǎn)外包服務市場研究報告》，弗若斯特沙利文咨詢公司，2021年5月
【2】《基因治療的研究進展》，中國細胞生物學學報，2020年4月
【3】《2022基因治療行業(yè)研究報告》，動脈網(wǎng)、蛋殼研究院，2022年6月
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