中文字幕一级黄色A级片|免费特级毛片。性欧美日本|偷拍亚洲欧美1级片|成人黄色中文小说网|A级片视频在线观看|老司机网址在线观看|免费一级无码激情黄所|欧美三级片区精品网站999|日韩av超碰日本青青草成人|一区二区亚洲AV婷婷

近期，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院蔣海越教授/劉霞研究員團(tuán)隊(duì)和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院周廣東教授團(tuán)隊(duì)在科愛出版創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表研究論文：研制了一種基于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的光敏多孔仿生生物墨水，并實(shí)現(xiàn)了耳廓軟骨的3D生物打印和體內(nèi)再生，為個(gè)性化耳廓形態(tài)軟骨的制備和再生提供了新材料和新方法。

01研究內(nèi)容簡介

耳廓作為人體面部的主要特征之一，耳廓發(fā)育畸形或缺損會嚴(yán)重影響患者的外觀及功能，對患者的身心健康造成嚴(yán)重影響。臨床常用的耳重建方法主要是自體肋軟骨耳支架，但存在創(chuàng)傷較大、對術(shù)者耳支架雕刻技術(shù)要求較高，且有并發(fā)氣胸和胸骨畸形的可能性。組織工程技術(shù)為耳廓重建提供了一種有前景的治療策略，近年來，3D生物打印技術(shù)的興起為組織工程提供了更加先進(jìn)的手段。本研究團(tuán)隊(duì)針對傳統(tǒng)水凝膠成分單一難以模擬軟骨微環(huán)境，質(zhì)地致密限制細(xì)胞行為以及力學(xué)性能差難以維持精確三維形態(tài)等技術(shù)瓶頸，研制了基于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的光敏水凝膠（ACMMA）仿生軟骨特異性微環(huán)境，應(yīng)用聚環(huán)氧乙烷（PEO）產(chǎn)生微孔結(jié)構(gòu)促進(jìn)細(xì)胞行為和軟骨形成，引入高強(qiáng)度和慢降解的聚己內(nèi)酯（PCL）形成支撐框架，整合多噴嘴3D生物打印技術(shù)，精確控制載軟骨細(xì)胞生物墨水和PCL的分布，制備了精確形態(tài)和良好力學(xué)性能的耳廓構(gòu)建物，并在體內(nèi)再生為形態(tài)保真度高、彈性好、有豐富的軟骨特異性ECM沉積的成熟耳廓軟骨樣組織，為個(gè)性化耳廓形態(tài)軟骨的制備和再生提供了新的策略。

Graphical Abstracts

一、軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)光敏水凝膠的制備

ACM被認(rèn)為是仿生軟骨特異性微環(huán)境的最有前途的生物材料之一，因?yàn)槠涑煞趾徒M成與天然軟骨相似。在本研究中，耳廓軟骨通過脫細(xì)胞和酶消化策略制備成軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)，定量結(jié)果證實(shí)了在去除細(xì)胞成分的同時(shí)，還保留了大部分的GAG和膠原成分。為了確定脫細(xì)胞程序后保留的ECM成分，對ACM和原生軟骨進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果證實(shí)了ACM中保留了大部分的ECM成分并發(fā)揮了重要的生物學(xué)功能，而丟失的成分大多與細(xì)胞成分有關(guān)，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了脫細(xì)胞的有效性。此外，對不同蛋白質(zhì)的功能富集分析為進(jìn)一步復(fù)合和修飾以制備更理想的仿生材料提供了信息支撐，這也為ACM仿生材料在軟骨組織工程中的應(yīng)用潛力和優(yōu)勢提供了有力的證據(jù)支持。

Fig. 1. 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備及蛋白組學(xué)分析

目前基于ACM的生物材料的可打印性和穩(wěn)定性不足，這阻礙了3D生物打印的實(shí)際應(yīng)用。為了滿足生物打印的要求，通過MA修飾使其具備光固化性能，核磁氫譜和理化特性也進(jìn)一步證實(shí)了MA的成功接枝，具備快速的光固化特性。然而，ACMMA水凝膠的可打印性和物理性能較差，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和形狀保真度有限。因此，加入了GelMA作為輔助材料，以平衡生物墨水的可打印性和穩(wěn)定性，同時(shí)補(bǔ)充脫細(xì)胞過程中損失的一些膠原蛋白成分。最后優(yōu)化生物墨水濃度和比例參數(shù)，平衡可打印性能和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

Fig. 2. 軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的甲基丙烯酸化機(jī)理和光交聯(lián)過程

二、多孔生物墨水的理化特性

水凝膠類支架在交聯(lián)固化后較為致密，會阻礙營養(yǎng)的交換而影響內(nèi)部軟骨組織的形成。鑒于這一點(diǎn)，本研究應(yīng)用了多孔水凝膠的構(gòu)建策略，如示意圖所示，以水溶性的犧牲材料PEO作為占位而產(chǎn)生微孔結(jié)構(gòu)，促進(jìn)了營養(yǎng)的交換，進(jìn)而有利于細(xì)胞的行為。PEO被添加到ACMMA/GelMA溶液中，導(dǎo)致ACMMA/GelMA和PEO水溶液的相分離，從而在去除未交聯(lián)的PEO液滴后，在交聯(lián)的ACMMA/GelMA水凝膠中產(chǎn)生孔隙。電鏡檢測觀察到多孔結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步通過光鏡、共聚焦、組織學(xué)等驗(yàn)證了水凝膠在正常培養(yǎng)條件下的孔隙結(jié)構(gòu)。同時(shí)，流變測試結(jié)果顯示， ACMMA/GelMA凝膠前體的粘度是可控的，并隨著剪切率的增加而降低。這種剪切變稀的特性適合于打印含有活細(xì)胞的生物墨水，而不會影響細(xì)胞的存活。同時(shí)，水凝膠表現(xiàn)出對溫度的高度敏感性，當(dāng)溫度達(dá)到凝膠化溫度時(shí)，模量迅速增加，表明通過調(diào)整擠壓壓力、速率和溫度，可以使其具備良好的打印性能，并適于打印活體組織或器官。

Fig. 3. 多孔水凝膠的物理化學(xué)性質(zhì).

三、多孔生物墨水的生物相容性

平衡墨水的可打印性和細(xì)胞行為一直是一個(gè)挑戰(zhàn)，因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞被嵌入密集的聚合物網(wǎng)絡(luò)時(shí)，重要的細(xì)胞過程，如存活、遷移、增殖和ECM沉積會受到阻礙，但密集的網(wǎng)絡(luò)通常有利于支持最佳的形狀保真度和長期穩(wěn)定性。為了驗(yàn)證多孔結(jié)構(gòu)對細(xì)胞行為的影響，本研究進(jìn)行了細(xì)胞遷移和增殖實(shí)驗(yàn)。遷移結(jié)果顯示，多孔水凝膠組有大量細(xì)胞可以遷移到對側(cè)，而對照組未觀察到明顯的細(xì)胞遷移?；?死細(xì)胞染色和DNA定量顯示，多孔水凝膠組的細(xì)胞增殖要明顯優(yōu)于對照組。同時(shí)，Ki67免疫熒光和流式細(xì)胞周期分析也進(jìn)一步證實(shí)了多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的增殖，我們分析多孔結(jié)構(gòu)更有利于營養(yǎng)物質(zhì)和代謝廢物的擴(kuò)散和交換，從而促進(jìn)細(xì)胞的活性和增殖。裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞外基質(zhì)的分泌和軟骨組織形成。綜合上述結(jié)果，證實(shí)了多孔水凝膠為細(xì)胞的生物活性提供了一個(gè)合適的三維微環(huán)境，更有利于細(xì)胞的遷移、增殖和基質(zhì)分泌。

Fig. 5. 多孔水凝膠-軟骨細(xì)胞構(gòu)建物的體內(nèi)軟骨再生 

四、基于ACMMA多孔仿生生物墨水進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生

在成功制備基于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)多孔水凝膠后， 3D生物打印精確形態(tài)的耳廓構(gòu)建物，回植裸鼠體內(nèi)半年，形態(tài)維持滿意，且去除外力時(shí)，能迅速恢復(fù)到原來的形態(tài)，表明其具有良好的彈性性能。進(jìn)一步量化耳廓形態(tài)維持度，用Micro CT三維掃描再生耳廓軟骨，通過三維重建與打印模型做偏差分析，形態(tài)相似性以偏差色譜的形式顯示，在±1mm內(nèi)的相似度達(dá)到86%。同時(shí)，組織學(xué)檢測顯示，耳廓構(gòu)建物形成了成熟的軟骨樣組織，具有顯著的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，以及豐富的GAG和II型膠原蛋白沉積。

Fig. 6. 基于ACMMA多孔生物墨水進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生.

五、基于ACMMA多孔仿生生物墨水和PCL內(nèi)核支撐進(jìn)行耳廓軟骨的生物打印和再生

為了進(jìn)一步提高構(gòu)建物的機(jī)械強(qiáng)度，以達(dá)到更好地維持三維形態(tài)，引入了經(jīng)FDA批準(zhǔn)用于臨床應(yīng)用的高強(qiáng)度和慢速降解的PCL作為網(wǎng)格框架以提供足夠的機(jī)械支持，保持更高的形態(tài)保真度。本研究應(yīng)用多噴嘴3D生物打印機(jī)，在保證細(xì)胞高存活率的前提下，協(xié)調(diào)不同的噴嘴和材料的有序配合，以確保整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。將人耳廓的三維數(shù)字模型設(shè)計(jì)成生物墨水和PCL交替排列的混合結(jié)構(gòu)，保證每條PCL的兩邊都被生物墨水包裹，避免與體內(nèi)組織直接接觸。在逐層打印的過程中，每一層PCL沉積后靜置10秒鐘，待其冷卻，再沉積生物墨水，以減少PCL高溫造成的細(xì)胞損傷。此外，整體結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性主要取決于相交的PCL。由于PCL的疏水性，水凝膠不僅不能與PCL牢固結(jié)合，還會影響PCL線條之間的結(jié)合。因此，打印模型中的每條PCL線條需要打印兩次，以確保每層PCL線條的高度超過水凝膠，從而保證層間PCL的牢固結(jié)合。經(jīng)過一系列的參數(shù)優(yōu)化，成功構(gòu)建了復(fù)合PCL的耳廓構(gòu)建物。在裸鼠體內(nèi)也成功再生為耳廓軟骨組織。值得注意的是，有PCL支持的再生耳廓軟骨表現(xiàn)出足夠的強(qiáng)度和剛度，難以被外力變形。三維重建的形態(tài)相似度結(jié)果顯示，在±1mm內(nèi)的相似度達(dá)到了94%，在±2mm內(nèi)的相似度達(dá)到了98%。組織學(xué)顯示，PCL的占位雖然影響了局部軟骨的形成，但并不影響生物墨水區(qū)域的軟骨形成。PCL的引入顯著提高了耳廓結(jié)構(gòu)的形態(tài)保真度，但唯一不足的是緩慢降解的PCL占位影響了工程軟骨的整合，下一步為了同時(shí)保證力學(xué)性能和組織形成，PCL的比例和分布還需要進(jìn)一步的探索和優(yōu)化。

Fig. 7.基于ACMMA多孔生物墨水和PCL進(jìn)行耳廓軟骨3D生物打印和再生。

Fig. 8. 再生耳軟骨的定量分析。

綜上所述，本研究團(tuán)隊(duì)成功制備了基于軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的光敏多孔仿生生物墨水，應(yīng)用多噴頭3D生物打印技術(shù)，成功體外構(gòu)建并在裸鼠體內(nèi)再生出形態(tài)滿意，力學(xué)良好的成熟耳廓軟骨組織，為個(gè)性化耳廓形態(tài)軟骨的制備和再生提供了新材料和新方法。后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化耳廓構(gòu)建的制備參數(shù)，并在大動(dòng)物模型中進(jìn)行驗(yàn)證，為患者個(gè)性化軟骨構(gòu)建及臨床應(yīng)用提供有效策略。