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近期，美國斯蒂文斯理工學(xué)院王紅軍教授和南開大學(xué)朱美峰研究員在Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表研究文章：通過3D打印聚電解質(zhì)復(fù)合物制作用于組織再生的多孔道生物支架。限制組織工程臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一，是無法創(chuàng)建大體積并擁有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的再生組織。在這里研究者通過嵌入式3D打?。‥B3DP）聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）和澆鑄的方法，實現(xiàn)了在支架內(nèi)創(chuàng)建微通道網(wǎng)絡(luò)。

 

01研究內(nèi)容簡介

 

在體外制造組織工程構(gòu)建物或在體內(nèi)進(jìn)行病變或受損組織的修復(fù)時，支架引導(dǎo)的組織再生仍然是主流。通常情況下，由不同材料制成的支架將為貼附細(xì)胞創(chuàng)造一個適宜的生長微環(huán)境。一般來說，這種支架應(yīng)具備一個相互連接的孔道網(wǎng)絡(luò)，孔道具有理想的尺寸、精巧的分層結(jié)構(gòu)和優(yōu)化的生物學(xué)分區(qū)。具備孔道的生物支架材料不僅能促進(jìn)可控的細(xì)胞活動（如附著、遷移和分化），并且能在新組織形成期間帶來充足的營養(yǎng)供給。越來越多的證據(jù)表明，在支架設(shè)計中納入結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性可以更好地模仿細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的獨特機(jī)械和生物功能，并在空間中引導(dǎo)形成具有取向性的生物組織，如血管和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。

 

因此，本研究打算開發(fā)一種廣泛適用的方法，探索使用聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）作為打印墨水，生產(chǎn)制備具有任意形態(tài)的可犧牲模板支架，并廣泛匹配各種澆鑄材料（如聚合物熔體、合成和天然聚合物溶液、熱敏水凝膠和光交聯(lián)水凝膠），通過PEC對外部刺激（如pH值和離子濃度）的敏感解離反應(yīng)，制造出含有三維分層和任意通道結(jié)構(gòu)的生物支架（圖1）。這項研究不僅證明了在生物支架內(nèi)創(chuàng)建分層通道網(wǎng)絡(luò)的可能性，而且還提供了一個有效的途徑來快速可重復(fù)地設(shè)計孔道結(jié)構(gòu)，以便在組織工程領(lǐng)域?qū)哂懈飨虍愋院蛷?fù)雜性的細(xì)胞進(jìn)行空間引導(dǎo)再生。

 

 

圖1. 通過3D打印的可犧牲聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）模板輔助策略，形成具有三維分層、任意構(gòu)型的多功能孔道支架的關(guān)鍵步驟示意圖。

 

一、可打印的PEC墨水的制備與表征

 

聚（二烯丙基二甲基氯化銨）（PDADMAC）和聚（4-苯乙烯磺酸鈉）（PSS）的聚電解質(zhì)被認(rèn)為是一個充滿潛力的PEC耦合對，它們表現(xiàn)出良好的結(jié)合強(qiáng)度、快速的結(jié)合速率、對離子強(qiáng)度的敏感性（結(jié)合/解離）、對高溫的耐受性（高達(dá)350℃）、相對較高的硬度（∼10MPa）和可忽略的細(xì)胞毒性。如圖2A所示，將PDADMAC和PSS以單體單位2.50M的濃度以1:1的體積比混合，通過內(nèi)在的靜電相互作用可以導(dǎo)致快速結(jié)合（<1分鐘）生成PEC。從理論上講，許多類型的鹽可以用來部分或完全解離PEC，并呈現(xiàn)可調(diào)節(jié)的粘度。解離速度主要依賴于生成PEC的電解質(zhì)耦合對的強(qiáng)度、離子擴(kuò)散系數(shù)和鹽的解離速度。溴化鉀（KBr）在本研究中被特別選擇，因為它被證明有能力比氯化鈉更快地達(dá)到摻雜平衡。如圖2B所示，隨著KBr濃度的增加，PDADMAC/PSS復(fù)合物逐漸被來自PEC "外在位點 "的反離子（即K+和Br-）補(bǔ)償。在較低的KBr濃度（≤1.50M KBr）下，PEC被塑化，同時保持物理上的完整。當(dāng)KBr濃度增加到1.75M時，PEC變成了一種粘稠的液體（稱為 "共析物"），其粘度適合于擠出打印，不會因為剪切引起的壓力下降而堵塞打印噴頭（圖2C）。隨著KBr濃度的進(jìn)一步增加（≥2.00M KBr），PEC中預(yù)耦合的PDADMAC/PSS被KBr離子完全解離，形成一個均勻的溶液。鑒于PEC（PDADMAC/PSS）通過添加水或高濃度KBr可逆的沉淀/溶解機(jī)制，它不僅提供了一個可控的方法來調(diào)節(jié)PEC墨水的粘度以便進(jìn)行3D打印，而且還提供了一個方便和 "綠色 "的手段來去除和回收作為犧牲模板的PEC支架。如圖2D所示，PEC支架可以迅速溶解在2.00M的KBr溶液中，并在降低KBr濃度后重新沉淀。在離心和清洗后，沉淀的PEC可以被收集并重新溶解在1.75M的KBr中，形成可打印的凝聚物，使環(huán)保和成本效益達(dá)到了平衡。

 

 

圖2. PEC打印墨水關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化和PEC可犧牲模板的回收過程。A）用于嵌入式3D打印（EB3DP）的PEC墨水的制備示意圖。B）不同濃度KBr水溶液中PEC沉淀物溶解的宏觀圖像。C) 溶解在不同濃度的KBr溶液中的PEC的流變曲線。D) 3D打印的PEC模板的完整回收過程。

 

二、在Pluronic 127水凝膠中進(jìn)行嵌入式3D打印制備PEC可犧牲支架

 

為了利用嵌入式3D打印制備任意形貌的PEC可犧牲支架，研究者利用了三嵌段共聚物Pluronic F127的熱可逆凝膠行為，使其扮演打印支撐基質(zhì)（圖3A）。25%（w/v）的Pluronic F127水溶液可在室溫（臨界點溫度為22℃∼）下凝膠化，同時表現(xiàn)出 "剪切稀化能力"，即為水凝膠剪切應(yīng)力因移動的打印噴頭的剪切速率增加而急劇下降。在這方面，研究者測試了與剪切應(yīng)力有關(guān)的儲存模量的變化。如圖3C所示，25%（w/v）的Pluronic F127（約30千帕）的儲存模量隨著剪切應(yīng)力的增加而減少，這表明快速移動的打印噴頭能通過剪切稀化作用使水凝膠局部液化，而隨著打印停止，Pluronic 127可以恢復(fù)凝膠狀態(tài)。另一方面，25%（w/v）的Pluronic F127剪切稀化特性也賦予了它自我修復(fù)的能力，可以立即填補(bǔ)打印噴頭快速移動造成的空隙，進(jìn)而防止印刷結(jié)構(gòu)因噴頭移動而發(fā)生潛在的變形（圖3B）。同時，Pluronic F127中存在水分也能使得打印的PEC快速凝固成型。此外，Pluronic F127的熱響應(yīng)相變將允許其在臨界溫度下迅速轉(zhuǎn)化為水溶液以釋放打印的可犧牲支架。

 

嵌入式3D打印的可控性和其他相關(guān)的邊界條件也在文中得到了逐一探究。圖3B示意性地說明了嵌入式3D打印的的裝置，其中PEC墨水以泵送速率Vp從一個內(nèi)徑為Dn，移動速度為Va的打印噴頭（26G）中擠出。由于其自身彈性和擠出的PEC的相關(guān)剪切稀化作用，預(yù)計會出現(xiàn)模具膨脹，即打印的纖維直徑D'大于Dn。這種模脹現(xiàn)象無疑會限制纖維直徑D'的大小，從而限制了打印的分辨率。幸運(yùn)的是，這樣的問題可以通過在嵌入式3D打印過程中，在25%（w/v）Pluronic F127內(nèi)塑化和拉伸PEC來部分克服。如圖3E所示，由于PEC和25%(w/v)的Pluronic F127之間不均勻的離子交換，凝固的PEC層會瞬間形成，包裹住擠出的PEC墨滴。同時，PEC墨水和Pluronic F127支撐基質(zhì)之間的內(nèi)在彈性模量差異允許將打印的PEC拉伸成具有均勻直徑D的纖維，這一過程也促進(jìn)了離子擴(kuò)散，以防止串珠或拖尾結(jié)構(gòu)的形成（圖3D）。最終，塑化/拉伸的穩(wěn)定狀態(tài)達(dá)成，其水含量、重新耦合的PEC對和周圍的反離子（圖3E）達(dá)到微妙的平衡。這保證了制造出具有高保真度和良好機(jī)械穩(wěn)定性的PEC可犧牲支架。研究還發(fā)現(xiàn)，通過分別調(diào)節(jié)Va和Vp，進(jìn)而可以控制打印纖維的粗細(xì)與形態(tài)（圖3F與3G）。例如，當(dāng)Vp/Va比率大于0.67μL mm-1時，由于印刷速度相對較慢，過多的PEC會積聚在打印噴頭的尖端，導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)的破壞。相反，當(dāng)Vp/Va比值低于0.008 μL mm-1時，過快的噴頭移動會將有限的PEC拖過支撐基體，導(dǎo)致扁平的纖維甚至串珠的形成。

 

 

圖3. 與制造PEC可犧牲模板有關(guān)的關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化。A）自制的3D打印機(jī)和嵌入式3D打印的示意圖。B)嵌入式3D打印過程示意圖。C）兩種濃度的Pluronic F127在室溫下的流變特性。D) 三個打印邊界條件的示意圖。E）在PEC打印纖維的形成過程中，25%（w/v）水溶液中的反離子、水和PEC耦合對的再平衡的示意圖闡述。F）Va和Vp的彩色編碼圖與PEC可打印性。G）1.75M KBr PEC共析物的纖維直徑與Vp/Va比值之間的相關(guān)性。

 

本研究還探索了打印各種疊加角度（15°、30°、45°、60°、75°和90°）（圖4Ca-f）、復(fù)雜圖案（三角形、波浪形和蜂窩狀）（圖4Cg-i）和多層疊加（圖4Cj-l）的PEC纖維結(jié)構(gòu)。特別是，多層PEC蜂窩圖案是以大尺寸（2厘米×2厘米×0.3厘米）連續(xù)和逐層打印的。每一層都有清晰的邊界（圖4Cl），這表明嵌入式3D打印可以隨時擴(kuò)大規(guī)模，生產(chǎn)大型復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。與水凝膠和基于糖熔體的結(jié)構(gòu)相比，打印的PEC結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出適度的機(jī)械強(qiáng)度和良好的靈活性。對干燥的10層PEC網(wǎng)格（圖4Da）進(jìn)行循環(huán)壓縮試驗，以90°覆蓋角從頂部或側(cè)面加載（圖4Db-c），證明了其從變形中恢復(fù)的能力，并沒有產(chǎn)生分層或結(jié)構(gòu)崩潰。除了干燥狀態(tài)，濕的6層PEC蜂巢結(jié)構(gòu)也通過用鑷子手動折疊來評估其彈性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖4E）。事實上，這里所測試的性能對于在不同的澆鑄材料上使用打印的PEC構(gòu)作為犧牲模板是至關(guān)重要的。

 

 

圖4. 在嵌入式3D打印過程中，PEC微纖維的不同空間構(gòu)型和相關(guān)的機(jī)械穩(wěn)定性。A) 各種纖維直徑和纖維間距離的立體顯微鏡圖像。比例尺：a）500μm；b）200μm。B）PEC纖維的SEM顯微照片。L-a）從1.75M KBr PEC共析物中打印的纖維的形態(tài)（L-b）。從1.75M KBr PEC共析物中提取的直徑為L-c)120 μm、L-d)200 μm和L-e)500 μm的PEC纖維的橫截面。比例尺：a）200μm；b）50μm；c）20μm；d）50μm；e）100μm。C) 15°到90°不同疊加角度的PEC纖維的立體顯微鏡圖像，復(fù)雜的圖案和多個疊加層。比例尺：a-i）500μm；j-l）2mm。D) 在干燥條件下的打印PEC可犧牲模板的特征。D-a）干燥的PEC模板。D-b）在循環(huán)壓縮測試下，干燥的PEC模板的機(jī)械穩(wěn)定性的宏觀演示。D-c）干燥的PEC可犧牲模板在第1個（藍(lán)色）和第20個（紅色）壓縮周期后的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。E）濕的PEC可犧牲模板的宏觀視圖（a）沒有折疊（b）和折疊（c），以顯示結(jié)構(gòu)的完整性。

 

三、在聚(1, 8-辛二醇-檸檬酸)(POC)鑄模內(nèi)形成微通道網(wǎng)絡(luò)

 

鑄模內(nèi)互連通道的形成受到打印分辨率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和犧牲模板的可移除性等影響（圖5A）。因此，本文試圖確定打印的PEC結(jié)構(gòu)是否適合作為可犧牲模板，在聚（1，8-辛二醇-檸檬酸）（POC）鑄模內(nèi)形成可灌注的開放微通道。為了更好地觀察POC鑄模內(nèi)的PEC可犧牲模板，在SEM下檢查了其橫截面?？梢院苋菀椎刈R別出PEC纖維，并看到了從圓形到橢圓形的變形（圖5Ba-b），這很可能是由于高溫和真空引起的PEC纖維的脫水。PEC去除所需的時間取決于PEC耦合對和反離子。實驗使用了PDADMAC/PSS和2.00M KBr，PEC模板從POC鑄型中溶解出來的時間為幾分鐘。在2.00M的KBr水溶液中浸泡15分鐘后，PEC模板從POC鑄型中完全去除，并通過SEM檢查確認(rèn)其橫截面，并形成開放的微通道（圖5Bc-e）。正如證實的那樣，這些微通道在疊加的PEC纖維的交界處連接良好（圖5Bc）。為了更好地評估微通道結(jié)構(gòu)的互連性和質(zhì)量運(yùn)輸?shù)男?，通過通道POC鑄型底部的開口注入庫馬西亮藍(lán)溶液（0.025%，w/v）（速度為2 mL h-1）（圖5Ca）。染料在整個通道中的時間分辨滲透很容易以逐層的方式發(fā)生（圖5Cb）。同樣地，具有其他形貌的打印PEC可犧牲模板也被測試了其在POC鑄型內(nèi)產(chǎn)生多功能開放通道結(jié)構(gòu)的能力（圖5D）。在移除PEC模板后，微通道彼此連接良好，并可灌注染料溶液（圖5Da-iv-d-iv）。為了更好地觀察管腔的空間組織，還對有通道的POC支架進(jìn)行了Micro-CT分析。如圖5E所示，這些由PEC模板（紅色標(biāo)記）形成的微通道顯示出三維分層結(jié)構(gòu)，與AutoCAD的設(shè)計高度。這些結(jié)果顯然表明，在打印出來的PEC可犧牲模板的幫助下，一個三維復(fù)雜的微通道網(wǎng)絡(luò)可以有效和可靠地在POC鑄件內(nèi)形成，并可能允許通過生理相關(guān)的灌注進(jìn)行自由質(zhì)量/氧氣運(yùn)輸。

 

 

圖5. 具有不同形貌的多功能孔道網(wǎng)絡(luò)的POC支架的形成。A）PEC可犧牲模板在POC鑄型內(nèi)形成相互連接的通道網(wǎng)絡(luò)的示意圖。B）在去除PEC可犧牲模板前后，帶有微通道的POC鑄型的橫截面的SEM顯微照片。比例尺。100μm。C) 表征POC鑄模內(nèi)相互連接的微通道的滲透性，其中C-a)中說明了實驗設(shè)置，C-b)中顯示了染色溶液（藍(lán)色）通過通道的延時滲透。比例尺：200μm。D) 具有不同通道結(jié)構(gòu)的孔道POC支架的顯微圖像（a-iii至d-iii）和滲透性（a-iv至d-iv），這些支架是通過將PEC模板（a-i至d-i）從PEC/POC鑄模（a-ii至d-ii）中移除而產(chǎn)生的。比例尺：a-b) 200 μm；c-d) 500μm。E）根據(jù)Micro-CT掃描的俯視圖（a-ii至b-ii）和側(cè)視圖（a-iii至b-iii），確認(rèn)在POC（黃色）內(nèi)形成與原始設(shè)計（a-i至b-i）類似的理想的開放微通道（紅色）。

 

四、利用PEC可犧牲模板在不同的可澆鑄材料中形成微通道

 

為了進(jìn)一步確定這種PEC可犧牲模板方法的靈活性和通用性，我們探索了其他常用的天然（如瓊脂糖和膠原蛋白）或合成（如GelMA和聚苯乙烯）材料中創(chuàng)造可灌注的微通道（圖6A）。更重要的是，這些澆鑄材料，依靠不同的方式來凝固（即pH值和熱反應(yīng)的凝膠化，紫外線誘導(dǎo)的交聯(lián)，以及有機(jī)溶劑蒸發(fā)），并沒有對PEC模板（即5層90°覆蓋的網(wǎng)格）造成明顯的破壞（圖6Aa-d-i&ii）。用2.00M的KBR溶液浸潤這些支架以溶解PEC可犧牲模板后，并不影響通道支架的結(jié)構(gòu)完整性。與POC類似，用瓊脂糖也觀察到熱誘導(dǎo)的微通道變形（圖6a-iv）。相比之下，其余材料都獲得了圓形通道（圖6Aa-d-iii和-iv）。有趣的是，根據(jù)澆鑄材料的不同，觀察到PEC纖維（直徑200微米）的微通道的收縮率不同。用ImageJ分析顯微鏡圖像，發(fā)現(xiàn)瓊脂糖的收縮率最高（10.4%），其次是聚苯乙烯（PS，7.2%）、GelMA（5.3%）和膠原蛋白（3.7%）（圖6B）。注意到的微通道尺寸的變化很可能是由于在澆鑄材料的凝固過程中印刷的PEC模板的失水造成的。顯然，與水凝膠（GelMA和膠原蛋白）相比，有機(jī)溶劑蒸發(fā)（PS為氯仿）和高溫處理（瓊脂糖為120℃）將不可避免地減少PEC模板的水含量。盡管有收縮，但PEC模板始終支持在這些基質(zhì)中發(fā)展開放和相互連接的微通道。據(jù)我們所知，沒有其他報道的犧牲性模板證明與如此廣泛的可澆鑄材料兼容。此外，PEC模板的通道形成也可以很容易地與其他致孔的方法（如凍干、氣體發(fā)泡和顆粒浸出）相結(jié)合，以制造出在孔隙中具有相互連接的分層通道的支架（圖6Ca）。例如，在凍干和戊二醛交聯(lián)后，將PEC模板從40%（w/v）的絲纖維素（SF）中移除，可以在SF基質(zhì)的微米和亞微米大小的孔隙（2-20μm）中形成微通道（圖6Cb-c）。同樣，在凍干后，交聯(lián)的10% GelMA微米大小的孔隙（40-80μm）中可以形成PEC誘導(dǎo)的微通道（圖6Ce）。結(jié)果支架的MicroCT分析顯示，SF支架（76±2%）和GelMA支架（79±3%）的孔隙率相當(dāng)（圖6D）。

 

 

圖6. 由多功能可鑄生物材料形成的通道支架。A）在（a-i&ii至d-i&ii）和（a-iii&iv至d-iii&iv）去除PEC可犧牲模板之前和之后，由瓊脂糖（Aa）、甲基丙烯酸明膠（GelMA）（Ab）、膠原蛋白（Ac）和PS（Ad）制備的通道支架的顯微鏡圖像。B）去除PEC后不同材料內(nèi)的通道收縮量的量化。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不顯著）。C) 通道網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展與其他致孔方法（如顆粒浸出、凍干、氣體發(fā)泡）相結(jié)合（Ca），形成具有多尺度多孔結(jié)構(gòu)的通道支架，如凍干后的SF（Cb-d）和GelMA（Ce-f）。嵌入SF澆鑄材料中的PEC模板的SEM顯微照片（Cb-i和ii），以及與沒有通道的SF凍干支架（Cd）相比，去除PEC模板后凍干孔隙中形成的微通道（Cc-i和ii）。具有額外凍干孔的通道GelMA支架的SEM顯微照片（Ce-i和ii），與沒有通道的支架不同（Cf）。比例尺。100 μm。D) 通過Micro-CT掃描確定，帶有凍干孔的GelMA和SF微通道支架的孔隙率具有可比性。(n≥5，NS：不顯著）。

 

五、孔道支架的體外組織形成

 

在凍干絲素蛋白的支架中引入微通道，預(yù)計不僅能促進(jìn)其與外界質(zhì)量交換，還能支持細(xì)胞浸潤和組織形成。這里，我們選擇了三種具有不同通道直徑（CD）（200或400微米）和通道間距離（ICD）（600或800微米）的絲素蛋白支架來證明微通道能促進(jìn)組織的形成。在體外細(xì)胞培養(yǎng)方面，用小鼠成纖維細(xì)胞（STO細(xì)胞，1×105細(xì)胞/支架）動態(tài)播種，然后在生物反應(yīng)器中連續(xù)攪拌培養(yǎng)（圖7A），這表明它有能力實現(xiàn)細(xì)胞在支架之間的均勻分布，并支持細(xì)胞的持續(xù)增殖和ECM沉積。培養(yǎng)的生物支架橫截面的H&E染色也顯示出更多的細(xì)胞和新組織位于內(nèi)部孔隙中，主要通過微通道生長（圖7D）。為了更好地觀察新的ECM沉積，還用Masson's三色染色法對膠原蛋白進(jìn)行了染色。如圖7E所示，新合成的膠原蛋白（藍(lán)色）的沉積只發(fā)生在非通道的SF支架的外圍區(qū)域。雖然非通道SF支架的微孔有利于質(zhì)量交換，但其尺寸可能太小，細(xì)胞無法浸潤。相反，在另一組的整個微通道中看到了大量的膠原蛋白，證實了這種微通道在促進(jìn)質(zhì)量交換和支持新組織形成方面的高效。

 

 

圖7. 小鼠成纖維細(xì)胞（STO細(xì)胞）在有通道和無通道的SF支架內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)，以評估其對組織形成的支持性。A）細(xì)胞播種和在生物反應(yīng)器內(nèi)的連續(xù)培養(yǎng)條件的示意圖。B) 培養(yǎng)1、7和14天后，STO細(xì)胞在支架B和非通道對照內(nèi)的附著和增殖的定量分析。細(xì)胞增殖是通過MTS檢測間接測量的。(n≥5，*p＜0.05，NS：不顯著）。C）用于創(chuàng)建不同通道支架的PEC可犧牲模板（A，B，C）的形態(tài)。 ai-ci）PEC可犧牲模板的SEM顯微照片。比例尺：200μm aii-cii) PEC可犧牲模板的立體顯微鏡圖像。比例尺：500μm。表2總結(jié)了不同支架的關(guān)鍵屬性。D) 培養(yǎng)的生物支架的H&E染色橫截面的代表性顯微圖像，顯示了非通道對照（Da）和支架B（Db）在培養(yǎng)1、7和14天后的細(xì)胞分布和組織形成。比例尺：200μm。 #：通道的橫截面。黑色箭頭：細(xì)胞和新形成的組織。D) 培養(yǎng)的生物支架Masson's三色染色橫截面的代表性顯微圖像，以更好地顯示非通道對照（Ea）支架B（Eb）內(nèi)新合成的膠原蛋白（藍(lán)色）以及培養(yǎng)7天和14天后的情況。比例尺：200μm。 #：通道的橫斷面。

 

六、孔道支架的體內(nèi)組織再生和血管化

 

為了評估孔道支架對組織生長的功效，并探索各種配置（即CD和ICD）與細(xì)胞化、血管化和免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)性，研究選擇了通道式SF支架（支架A、B和C）和非通道式SF支架（對照組）皮下植入Sprague-Dawley大鼠的背部（圖8A）。植入2周和4周后的外植體的組織學(xué)分析（H&E染色）顯示，通道支架的組織主要通過通道生長，這在支架A（圖8Bb）中很明顯，該支架有一個小的CD（200μm）和大的ICD（800μm）。增加CD（支架C）或減少ICD（支架B）能夠明顯促進(jìn)組織的生長（圖8Bc和d）。非通道支架上的組織生長極少，只在表層區(qū)域或支架周圍發(fā)生（圖8Ba）。與非通道支架或支架A內(nèi)有限的微血管相比，支架B和C內(nèi)的微血管數(shù)量增加（黃色箭頭）。為了更好地觀察血管，還進(jìn)行了Von Willebrand因子（VWF）的免疫熒光染色。如圖8中的黃色箭頭所示，更多的毛細(xì)血管通過支架B和C的微通道形成。顯然，細(xì)胞浸潤和血管化都與相互連接的微通道和增加的孔隙度有很好的關(guān)聯(lián)。在體內(nèi)植入任何異物都會不可避免地誘發(fā)入侵的巨噬細(xì)胞的極化，即iNOS陽性的促炎癥巨噬細(xì)胞（M1）或CD206陽性的抗炎癥巨噬細(xì)胞（M2）。植入4周后，這些標(biāo)記物的免疫熒光染色證實，CD206和iNOS陽性細(xì)胞分布在整個通道支架的微通道內(nèi)（圖8D）。相比之下，巨噬細(xì)胞主要分布在非通道式支架的外圍邊界區(qū)域。圖像分析進(jìn)一步顯示，通道化支架中CD206陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯高于非通道化對照組，而通道化支架中iNOS陽性細(xì)胞的數(shù)量與對照組支架接近。這些數(shù)據(jù)表明，通道化的SF支架具有更好的免疫調(diào)節(jié)和生物相容性。到目前為止，所有的結(jié)果都證明了通道式支架在通過鼓勵細(xì)胞化和血管化來促進(jìn)組織生長方面的優(yōu)越性。

 

 

圖8. 在體內(nèi)植入各種有通道和無通道的SF支架以評估微通道對組織生長的影響。A）實驗裝置的示意圖，其中通道支架（支架A、B和C）或非通道支架（對照）被植入大鼠的皮下。B）皮下植入2周（Ba-i至Bd-i）和4周（Ba-ii至Bd-ii）后，外植體的H&E染色截面的代表性顯微鏡圖像。比例尺：200μm。#：通道的橫截面。黑色箭頭：新形成的組織。黃色箭頭：新形成的毛細(xì)血管。C）皮下植入2和4周后，不同支架內(nèi)組織生長的半定量表征。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不顯著）。D) 對vWF（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行免疫熒光染色后，新血管形成的外植體截面（Da-i至Dc-i）的代表性熒光圖像。炎癥性巨噬細(xì)胞（Da-ii至Dc-ii）在免疫熒光染色iNOS（紅色）和DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記后，以及抗炎性巨噬細(xì)胞（Da-iii至Dc-iii）在免疫熒光染色CD206（綠色）和DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記后。比例尺。100 μm。 #：通道的橫切面。黃色箭頭：新形成的毛細(xì)血管。

 

最后，作者指出，PEC生物墨水和Pluronic F127支持基質(zhì)在嵌入式3D打印中的優(yōu)化組合可以確定幾個相關(guān)的創(chuàng)新，包括1）在高打印分辨率下形成復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，2）相對較低的規(guī)?；系K，以及3）制造過程中強(qiáng)大的容錯性。分層通道網(wǎng)絡(luò)在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出良好的通暢性，能促進(jìn)質(zhì)量交換以維持高細(xì)胞活力，并在皮下植入后促進(jìn)組織再生和整合。這樣的孔道支架將大大有利于生理相關(guān)組織的形成，可以用于體外測試組織模型或體內(nèi)重建手術(shù)。