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近期，美國(guó)斯蒂文斯理工學(xué)院王紅軍教授和南開(kāi)大學(xué)朱美峰研究員在Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表研究文章：通過(guò)3D打印聚電解質(zhì)復(fù)合物制作用于組織再生的多孔道生物支架。限制組織工程臨床轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一，是無(wú)法創(chuàng)建大體積并擁有復(fù)雜三維結(jié)構(gòu)的再生組織。在這里研究者通過(guò)嵌入式3D打印（EB3DP）聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）和澆鑄的方法，實(shí)現(xiàn)了在支架內(nèi)創(chuàng)建微通道網(wǎng)絡(luò)。

 

01研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介

 

在體外制造組織工程構(gòu)建物或在體內(nèi)進(jìn)行病變或受損組織的修復(fù)時(shí)，支架引導(dǎo)的組織再生仍然是主流。通常情況下，由不同材料制成的支架將為貼附細(xì)胞創(chuàng)造一個(gè)適宜的生長(zhǎng)微環(huán)境。一般來(lái)說(shuō)，這種支架應(yīng)具備一個(gè)相互連接的孔道網(wǎng)絡(luò)，孔道具有理想的尺寸、精巧的分層結(jié)構(gòu)和優(yōu)化的生物學(xué)分區(qū)。具備孔道的生物支架材料不僅能促進(jìn)可控的細(xì)胞活動(dòng)（如附著、遷移和分化），并且能在新組織形成期間帶來(lái)充足的營(yíng)養(yǎng)供給。越來(lái)越多的證據(jù)表明，在支架設(shè)計(jì)中納入結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性可以更好地模仿細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的獨(dú)特機(jī)械和生物功能，并在空間中引導(dǎo)形成具有取向性的生物組織，如血管和神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)。

 

因此，本研究打算開(kāi)發(fā)一種廣泛適用的方法，探索使用聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）作為打印墨水，生產(chǎn)制備具有任意形態(tài)的可犧牲模板支架，并廣泛匹配各種澆鑄材料（如聚合物熔體、合成和天然聚合物溶液、熱敏水凝膠和光交聯(lián)水凝膠），通過(guò)PEC對(duì)外部刺激（如pH值和離子濃度）的敏感解離反應(yīng)，制造出含有三維分層和任意通道結(jié)構(gòu)的生物支架（圖1）。這項(xiàng)研究不僅證明了在生物支架內(nèi)創(chuàng)建分層通道網(wǎng)絡(luò)的可能性，而且還提供了一個(gè)有效的途徑來(lái)快速可重復(fù)地設(shè)計(jì)孔道結(jié)構(gòu)，以便在組織工程領(lǐng)域?qū)哂懈飨虍愋院蛷?fù)雜性的細(xì)胞進(jìn)行空間引導(dǎo)再生。

 

 

圖1. 通過(guò)3D打印的可犧牲聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）模板輔助策略，形成具有三維分層、任意構(gòu)型的多功能孔道支架的關(guān)鍵步驟示意圖。

 

一、可打印的PEC墨水的制備與表征

 

聚（二烯丙基二甲基氯化銨）（PDADMAC）和聚（4-苯乙烯磺酸鈉）（PSS）的聚電解質(zhì)被認(rèn)為是一個(gè)充滿潛力的PEC耦合對(duì)，它們表現(xiàn)出良好的結(jié)合強(qiáng)度、快速的結(jié)合速率、對(duì)離子強(qiáng)度的敏感性（結(jié)合/解離）、對(duì)高溫的耐受性（高達(dá)350℃）、相對(duì)較高的硬度（∼10MPa）和可忽略的細(xì)胞毒性。如圖2A所示，將PDADMAC和PSS以單體單位2.50M的濃度以1:1的體積比混合，通過(guò)內(nèi)在的靜電相互作用可以導(dǎo)致快速結(jié)合（<1分鐘）生成PEC。從理論上講，許多類型的鹽可以用來(lái)部分或完全解離PEC，并呈現(xiàn)可調(diào)節(jié)的粘度。解離速度主要依賴于生成PEC的電解質(zhì)耦合對(duì)的強(qiáng)度、離子擴(kuò)散系數(shù)和鹽的解離速度。溴化鉀（KBr）在本研究中被特別選擇，因?yàn)樗蛔C明有能力比氯化鈉更快地達(dá)到摻雜平衡。如圖2B所示，隨著KBr濃度的增加，PDADMAC/PSS復(fù)合物逐漸被來(lái)自PEC "外在位點(diǎn) "的反離子（即K+和Br-）補(bǔ)償。在較低的KBr濃度（≤1.50M KBr）下，PEC被塑化，同時(shí)保持物理上的完整。當(dāng)KBr濃度增加到1.75M時(shí)，PEC變成了一種粘稠的液體（稱為 "共析物"），其粘度適合于擠出打印，不會(huì)因?yàn)榧羟幸鸬膲毫ο陆刀氯蛴婎^（圖2C）。隨著KBr濃度的進(jìn)一步增加（≥2.00M KBr），PEC中預(yù)耦合的PDADMAC/PSS被KBr離子完全解離，形成一個(gè)均勻的溶液。鑒于PEC（PDADMAC/PSS）通過(guò)添加水或高濃度KBr可逆的沉淀/溶解機(jī)制，它不僅提供了一個(gè)可控的方法來(lái)調(diào)節(jié)PEC墨水的粘度以便進(jìn)行3D打印，而且還提供了一個(gè)方便和 "綠色 "的手段來(lái)去除和回收作為犧牲模板的PEC支架。如圖2D所示，PEC支架可以迅速溶解在2.00M的KBr溶液中，并在降低KBr濃度后重新沉淀。在離心和清洗后，沉淀的PEC可以被收集并重新溶解在1.75M的KBr中，形成可打印的凝聚物，使環(huán)保和成本效益達(dá)到了平衡。

 

 

圖2. PEC打印墨水關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化和PEC可犧牲模板的回收過(guò)程。A）用于嵌入式3D打?。‥B3DP）的PEC墨水的制備示意圖。B）不同濃度KBr水溶液中PEC沉淀物溶解的宏觀圖像。C) 溶解在不同濃度的KBr溶液中的PEC的流變曲線。D) 3D打印的PEC模板的完整回收過(guò)程。

 

二、在Pluronic 127水凝膠中進(jìn)行嵌入式3D打印制備PEC可犧牲支架

 

為了利用嵌入式3D打印制備任意形貌的PEC可犧牲支架，研究者利用了三嵌段共聚物Pluronic F127的熱可逆凝膠行為，使其扮演打印支撐基質(zhì)（圖3A）。25%（w/v）的Pluronic F127水溶液可在室溫（臨界點(diǎn)溫度為22℃∼）下凝膠化，同時(shí)表現(xiàn)出 "剪切稀化能力"，即為水凝膠剪切應(yīng)力因移動(dòng)的打印噴頭的剪切速率增加而急劇下降。在這方面，研究者測(cè)試了與剪切應(yīng)力有關(guān)的儲(chǔ)存模量的變化。如圖3C所示，25%（w/v）的Pluronic F127（約30千帕）的儲(chǔ)存模量隨著剪切應(yīng)力的增加而減少，這表明快速移動(dòng)的打印噴頭能通過(guò)剪切稀化作用使水凝膠局部液化，而隨著打印停止，Pluronic 127可以恢復(fù)凝膠狀態(tài)。另一方面，25%（w/v）的Pluronic F127剪切稀化特性也賦予了它自我修復(fù)的能力，可以立即填補(bǔ)打印噴頭快速移動(dòng)造成的空隙，進(jìn)而防止印刷結(jié)構(gòu)因噴頭移動(dòng)而發(fā)生潛在的變形（圖3B）。同時(shí)，Pluronic F127中存在水分也能使得打印的PEC快速凝固成型。此外，Pluronic F127的熱響應(yīng)相變將允許其在臨界溫度下迅速轉(zhuǎn)化為水溶液以釋放打印的可犧牲支架。

 

嵌入式3D打印的可控性和其他相關(guān)的邊界條件也在文中得到了逐一探究。圖3B示意性地說(shuō)明了嵌入式3D打印的的裝置，其中PEC墨水以泵送速率Vp從一個(gè)內(nèi)徑為Dn，移動(dòng)速度為Va的打印噴頭（26G）中擠出。由于其自身彈性和擠出的PEC的相關(guān)剪切稀化作用，預(yù)計(jì)會(huì)出現(xiàn)模具膨脹，即打印的纖維直徑D'大于Dn。這種模脹現(xiàn)象無(wú)疑會(huì)限制纖維直徑D'的大小，從而限制了打印的分辨率。幸運(yùn)的是，這樣的問(wèn)題可以通過(guò)在嵌入式3D打印過(guò)程中，在25%（w/v）Pluronic F127內(nèi)塑化和拉伸PEC來(lái)部分克服。如圖3E所示，由于PEC和25%(w/v)的Pluronic F127之間不均勻的離子交換，凝固的PEC層會(huì)瞬間形成，包裹住擠出的PEC墨滴。同時(shí)，PEC墨水和Pluronic F127支撐基質(zhì)之間的內(nèi)在彈性模量差異允許將打印的PEC拉伸成具有均勻直徑D的纖維，這一過(guò)程也促進(jìn)了離子擴(kuò)散，以防止串珠或拖尾結(jié)構(gòu)的形成（圖3D）。最終，塑化/拉伸的穩(wěn)定狀態(tài)達(dá)成，其水含量、重新耦合的PEC對(duì)和周圍的反離子（圖3E）達(dá)到微妙的平衡。這保證了制造出具有高保真度和良好機(jī)械穩(wěn)定性的PEC可犧牲支架。研究還發(fā)現(xiàn)，通過(guò)分別調(diào)節(jié)Va和Vp，進(jìn)而可以控制打印纖維的粗細(xì)與形態(tài)（圖3F與3G）。例如，當(dāng)Vp/Va比率大于0.67μL mm-1時(shí)，由于印刷速度相對(duì)較慢，過(guò)多的PEC會(huì)積聚在打印噴頭的尖端，導(dǎo)致打印結(jié)構(gòu)的破壞。相反，當(dāng)Vp/Va比值低于0.008 μL mm-1時(shí)，過(guò)快的噴頭移動(dòng)會(huì)將有限的PEC拖過(guò)支撐基體，導(dǎo)致扁平的纖維甚至串珠的形成。

 

 

圖3. 與制造PEC可犧牲模板有關(guān)的關(guān)鍵參數(shù)的優(yōu)化。A）自制的3D打印機(jī)和嵌入式3D打印的示意圖。B)嵌入式3D打印過(guò)程示意圖。C）兩種濃度的Pluronic F127在室溫下的流變特性。D) 三個(gè)打印邊界條件的示意圖。E）在PEC打印纖維的形成過(guò)程中，25%（w/v）水溶液中的反離子、水和PEC耦合對(duì)的再平衡的示意圖闡述。F）Va和Vp的彩色編碼圖與PEC可打印性。G）1.75M KBr PEC共析物的纖維直徑與Vp/Va比值之間的相關(guān)性。

 

本研究還探索了打印各種疊加角度（15°、30°、45°、60°、75°和90°）（圖4Ca-f）、復(fù)雜圖案（三角形、波浪形和蜂窩狀）（圖4Cg-i）和多層疊加（圖4Cj-l）的PEC纖維結(jié)構(gòu)。特別是，多層PEC蜂窩圖案是以大尺寸（2厘米×2厘米×0.3厘米）連續(xù)和逐層打印的。每一層都有清晰的邊界（圖4Cl），這表明嵌入式3D打印可以隨時(shí)擴(kuò)大規(guī)模，生產(chǎn)大型復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。與水凝膠和基于糖熔體的結(jié)構(gòu)相比，打印的PEC結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出適度的機(jī)械強(qiáng)度和良好的靈活性。對(duì)干燥的10層PEC網(wǎng)格（圖4Da）進(jìn)行循環(huán)壓縮試驗(yàn)，以90°覆蓋角從頂部或側(cè)面加載（圖4Db-c），證明了其從變形中恢復(fù)的能力，并沒(méi)有產(chǎn)生分層或結(jié)構(gòu)崩潰。除了干燥狀態(tài)，濕的6層PEC蜂巢結(jié)構(gòu)也通過(guò)用鑷子手動(dòng)折疊來(lái)評(píng)估其彈性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性（圖4E）。事實(shí)上，這里所測(cè)試的性能對(duì)于在不同的澆鑄材料上使用打印的PEC構(gòu)作為犧牲模板是至關(guān)重要的。

 

 

圖4. 在嵌入式3D打印過(guò)程中，PEC微纖維的不同空間構(gòu)型和相關(guān)的機(jī)械穩(wěn)定性。A) 各種纖維直徑和纖維間距離的立體顯微鏡圖像。比例尺：a）500μm；b）200μm。B）PEC纖維的SEM顯微照片。L-a）從1.75M KBr PEC共析物中打印的纖維的形態(tài)（L-b）。從1.75M KBr PEC共析物中提取的直徑為L(zhǎng)-c)120 μm、L-d)200 μm和L-e)500 μm的PEC纖維的橫截面。比例尺：a）200μm；b）50μm；c）20μm；d）50μm；e）100μm。C) 15°到90°不同疊加角度的PEC纖維的立體顯微鏡圖像，復(fù)雜的圖案和多個(gè)疊加層。比例尺：a-i）500μm；j-l）2mm。D) 在干燥條件下的打印PEC可犧牲模板的特征。D-a）干燥的PEC模板。D-b）在循環(huán)壓縮測(cè)試下，干燥的PEC模板的機(jī)械穩(wěn)定性的宏觀演示。D-c）干燥的PEC可犧牲模板在第1個(gè)（藍(lán)色）和第20個(gè)（紅色）壓縮周期后的應(yīng)力-應(yīng)變曲線。E）濕的PEC可犧牲模板的宏觀視圖（a）沒(méi)有折疊（b）和折疊（c），以顯示結(jié)構(gòu)的完整性。

 

三、在聚(1, 8-辛二醇-檸檬酸)(POC)鑄模內(nèi)形成微通道網(wǎng)絡(luò)

 

鑄模內(nèi)互連通道的形成受到打印分辨率、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和犧牲模板的可移除性等影響（圖5A）。因此，本文試圖確定打印的PEC結(jié)構(gòu)是否適合作為可犧牲模板，在聚（1，8-辛二醇-檸檬酸）（POC）鑄模內(nèi)形成可灌注的開(kāi)放微通道。為了更好地觀察POC鑄模內(nèi)的PEC可犧牲模板，在SEM下檢查了其橫截面。可以很容易地識(shí)別出PEC纖維，并看到了從圓形到橢圓形的變形（圖5Ba-b），這很可能是由于高溫和真空引起的PEC纖維的脫水。PEC去除所需的時(shí)間取決于PEC耦合對(duì)和反離子。實(shí)驗(yàn)使用了PDADMAC/PSS和2.00M KBr，PEC模板從POC鑄型中溶解出來(lái)的時(shí)間為幾分鐘。在2.00M的KBr水溶液中浸泡15分鐘后，PEC模板從POC鑄型中完全去除，并通過(guò)SEM檢查確認(rèn)其橫截面，并形成開(kāi)放的微通道（圖5Bc-e）。正如證實(shí)的那樣，這些微通道在疊加的PEC纖維的交界處連接良好（圖5Bc）。為了更好地評(píng)估微通道結(jié)構(gòu)的互連性和質(zhì)量運(yùn)輸?shù)男?，通過(guò)通道POC鑄型底部的開(kāi)口注入庫(kù)馬西亮藍(lán)溶液（0.025%，w/v）（速度為2 mL h-1）（圖5Ca）。染料在整個(gè)通道中的時(shí)間分辨滲透很容易以逐層的方式發(fā)生（圖5Cb）。同樣地，具有其他形貌的打印PEC可犧牲模板也被測(cè)試了其在POC鑄型內(nèi)產(chǎn)生多功能開(kāi)放通道結(jié)構(gòu)的能力（圖5D）。在移除PEC模板后，微通道彼此連接良好，并可灌注染料溶液（圖5Da-iv-d-iv）。為了更好地觀察管腔的空間組織，還對(duì)有通道的POC支架進(jìn)行了Micro-CT分析。如圖5E所示，這些由PEC模板（紅色標(biāo)記）形成的微通道顯示出三維分層結(jié)構(gòu)，與AutoCAD的設(shè)計(jì)高度。這些結(jié)果顯然表明，在打印出來(lái)的PEC可犧牲模板的幫助下，一個(gè)三維復(fù)雜的微通道網(wǎng)絡(luò)可以有效和可靠地在POC鑄件內(nèi)形成，并可能允許通過(guò)生理相關(guān)的灌注進(jìn)行自由質(zhì)量/氧氣運(yùn)輸。

 

 

圖5. 具有不同形貌的多功能孔道網(wǎng)絡(luò)的POC支架的形成。A）PEC可犧牲模板在POC鑄型內(nèi)形成相互連接的通道網(wǎng)絡(luò)的示意圖。B）在去除PEC可犧牲模板前后，帶有微通道的POC鑄型的橫截面的SEM顯微照片。比例尺。100μm。C) 表征POC鑄模內(nèi)相互連接的微通道的滲透性，其中C-a)中說(shuō)明了實(shí)驗(yàn)設(shè)置，C-b)中顯示了染色溶液（藍(lán)色）通過(guò)通道的延時(shí)滲透。比例尺：200μm。D) 具有不同通道結(jié)構(gòu)的孔道POC支架的顯微圖像（a-iii至d-iii）和滲透性（a-iv至d-iv），這些支架是通過(guò)將PEC模板（a-i至d-i）從PEC/POC鑄模（a-ii至d-ii）中移除而產(chǎn)生的。比例尺：a-b) 200 μm；c-d) 500μm。E）根據(jù)Micro-CT掃描的俯視圖（a-ii至b-ii）和側(cè)視圖（a-iii至b-iii），確認(rèn)在POC（黃色）內(nèi)形成與原始設(shè)計(jì)（a-i至b-i）類似的理想的開(kāi)放微通道（紅色）。

 

四、利用PEC可犧牲模板在不同的可澆鑄材料中形成微通道

 

為了進(jìn)一步確定這種PEC可犧牲模板方法的靈活性和通用性，我們探索了其他常用的天然（如瓊脂糖和膠原蛋白）或合成（如GelMA和聚苯乙烯）材料中創(chuàng)造可灌注的微通道（圖6A）。更重要的是，這些澆鑄材料，依靠不同的方式來(lái)凝固（即pH值和熱反應(yīng)的凝膠化，紫外線誘導(dǎo)的交聯(lián)，以及有機(jī)溶劑蒸發(fā)），并沒(méi)有對(duì)PEC模板（即5層90°覆蓋的網(wǎng)格）造成明顯的破壞（圖6Aa-d-i&ii）。用2.00M的KBR溶液浸潤(rùn)這些支架以溶解PEC可犧牲模板后，并不影響通道支架的結(jié)構(gòu)完整性。與POC類似，用瓊脂糖也觀察到熱誘導(dǎo)的微通道變形（圖6a-iv）。相比之下，其余材料都獲得了圓形通道（圖6Aa-d-iii和-iv）。有趣的是，根據(jù)澆鑄材料的不同，觀察到PEC纖維（直徑200微米）的微通道的收縮率不同。用ImageJ分析顯微鏡圖像，發(fā)現(xiàn)瓊脂糖的收縮率最高（10.4%），其次是聚苯乙烯（PS，7.2%）、GelMA（5.3%）和膠原蛋白（3.7%）（圖6B）。注意到的微通道尺寸的變化很可能是由于在澆鑄材料的凝固過(guò)程中印刷的PEC模板的失水造成的。顯然，與水凝膠（GelMA和膠原蛋白）相比，有機(jī)溶劑蒸發(fā)（PS為氯仿）和高溫處理（瓊脂糖為120℃）將不可避免地減少PEC模板的水含量。盡管有收縮，但PEC模板始終支持在這些基質(zhì)中發(fā)展開(kāi)放和相互連接的微通道。據(jù)我們所知，沒(méi)有其他報(bào)道的犧牲性模板證明與如此廣泛的可澆鑄材料兼容。此外，PEC模板的通道形成也可以很容易地與其他致孔的方法（如凍干、氣體發(fā)泡和顆粒浸出）相結(jié)合，以制造出在孔隙中具有相互連接的分層通道的支架（圖6Ca）。例如，在凍干和戊二醛交聯(lián)后，將PEC模板從40%（w/v）的絲纖維素（SF）中移除，可以在SF基質(zhì)的微米和亞微米大小的孔隙（2-20μm）中形成微通道（圖6Cb-c）。同樣，在凍干后，交聯(lián)的10% GelMA微米大小的孔隙（40-80μm）中可以形成PEC誘導(dǎo)的微通道（圖6Ce）。結(jié)果支架的MicroCT分析顯示，SF支架（76±2%）和GelMA支架（79±3%）的孔隙率相當(dāng)（圖6D）。

 

 

圖6. 由多功能可鑄生物材料形成的通道支架。A）在（a-i&ii至d-i&ii）和（a-iii&iv至d-iii&iv）去除PEC可犧牲模板之前和之后，由瓊脂糖（Aa）、甲基丙烯酸明膠（GelMA）（Ab）、膠原蛋白（Ac）和PS（Ad）制備的通道支架的顯微鏡圖像。B）去除PEC后不同材料內(nèi)的通道收縮量的量化。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不顯著）。C) 通道網(wǎng)絡(luò)的發(fā)展與其他致孔方法（如顆粒浸出、凍干、氣體發(fā)泡）相結(jié)合（Ca），形成具有多尺度多孔結(jié)構(gòu)的通道支架，如凍干后的SF（Cb-d）和GelMA（Ce-f）。嵌入SF澆鑄材料中的PEC模板的SEM顯微照片（Cb-i和ii），以及與沒(méi)有通道的SF凍干支架（Cd）相比，去除PEC模板后凍干孔隙中形成的微通道（Cc-i和ii）。具有額外凍干孔的通道GelMA支架的SEM顯微照片（Ce-i和ii），與沒(méi)有通道的支架不同（Cf）。比例尺。100 μm。D) 通過(guò)Micro-CT掃描確定，帶有凍干孔的GelMA和SF微通道支架的孔隙率具有可比性。(n≥5，NS：不顯著）。

 

五、孔道支架的體外組織形成

 

在凍干絲素蛋白的支架中引入微通道，預(yù)計(jì)不僅能促進(jìn)其與外界質(zhì)量交換，還能支持細(xì)胞浸潤(rùn)和組織形成。這里，我們選擇了三種具有不同通道直徑（CD）（200或400微米）和通道間距離（ICD）（600或800微米）的絲素蛋白支架來(lái)證明微通道能促進(jìn)組織的形成。在體外細(xì)胞培養(yǎng)方面，用小鼠成纖維細(xì)胞（STO細(xì)胞，1×105細(xì)胞/支架）動(dòng)態(tài)播種，然后在生物反應(yīng)器中連續(xù)攪拌培養(yǎng)（圖7A），這表明它有能力實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在支架之間的均勻分布，并支持細(xì)胞的持續(xù)增殖和ECM沉積。培養(yǎng)的生物支架橫截面的H&E染色也顯示出更多的細(xì)胞和新組織位于內(nèi)部孔隙中，主要通過(guò)微通道生長(zhǎng)（圖7D）。為了更好地觀察新的ECM沉積，還用Masson's三色染色法對(duì)膠原蛋白進(jìn)行了染色。如圖7E所示，新合成的膠原蛋白（藍(lán)色）的沉積只發(fā)生在非通道的SF支架的外圍區(qū)域。雖然非通道SF支架的微孔有利于質(zhì)量交換，但其尺寸可能太小，細(xì)胞無(wú)法浸潤(rùn)。相反，在另一組的整個(gè)微通道中看到了大量的膠原蛋白，證實(shí)了這種微通道在促進(jìn)質(zhì)量交換和支持新組織形成方面的高效。

 

 

圖7. 小鼠成纖維細(xì)胞（STO細(xì)胞）在有通道和無(wú)通道的SF支架內(nèi)進(jìn)行體外培養(yǎng)，以評(píng)估其對(duì)組織形成的支持性。A）細(xì)胞播種和在生物反應(yīng)器內(nèi)的連續(xù)培養(yǎng)條件的示意圖。B) 培養(yǎng)1、7和14天后，STO細(xì)胞在支架B和非通道對(duì)照內(nèi)的附著和增殖的定量分析。細(xì)胞增殖是通過(guò)MTS檢測(cè)間接測(cè)量的。(n≥5，*p＜0.05，NS：不顯著）。C）用于創(chuàng)建不同通道支架的PEC可犧牲模板（A，B，C）的形態(tài)。 ai-ci）PEC可犧牲模板的SEM顯微照片。比例尺：200μm aii-cii) PEC可犧牲模板的立體顯微鏡圖像。比例尺：500μm。表2總結(jié)了不同支架的關(guān)鍵屬性。D) 培養(yǎng)的生物支架的H&E染色橫截面的代表性顯微圖像，顯示了非通道對(duì)照（Da）和支架B（Db）在培養(yǎng)1、7和14天后的細(xì)胞分布和組織形成。比例尺：200μm。 #：通道的橫截面。黑色箭頭：細(xì)胞和新形成的組織。D) 培養(yǎng)的生物支架Masson's三色染色橫截面的代表性顯微圖像，以更好地顯示非通道對(duì)照（Ea）支架B（Eb）內(nèi)新合成的膠原蛋白（藍(lán)色）以及培養(yǎng)7天和14天后的情況。比例尺：200μm。 #：通道的橫斷面。

 

六、孔道支架的體內(nèi)組織再生和血管化

 

為了評(píng)估孔道支架對(duì)組織生長(zhǎng)的功效，并探索各種配置（即CD和ICD）與細(xì)胞化、血管化和免疫調(diào)節(jié)的相關(guān)性，研究選擇了通道式SF支架（支架A、B和C）和非通道式SF支架（對(duì)照組）皮下植入Sprague-Dawley大鼠的背部（圖8A）。植入2周和4周后的外植體的組織學(xué)分析（H&E染色）顯示，通道支架的組織主要通過(guò)通道生長(zhǎng)，這在支架A（圖8Bb）中很明顯，該支架有一個(gè)小的CD（200μm）和大的ICD（800μm）。增加CD（支架C）或減少ICD（支架B）能夠明顯促進(jìn)組織的生長(zhǎng)（圖8Bc和d）。非通道支架上的組織生長(zhǎng)極少，只在表層區(qū)域或支架周圍發(fā)生（圖8Ba）。與非通道支架或支架A內(nèi)有限的微血管相比，支架B和C內(nèi)的微血管數(shù)量增加（黃色箭頭）。為了更好地觀察血管，還進(jìn)行了Von Willebrand因子（VWF）的免疫熒光染色。如圖8中的黃色箭頭所示，更多的毛細(xì)血管通過(guò)支架B和C的微通道形成。顯然，細(xì)胞浸潤(rùn)和血管化都與相互連接的微通道和增加的孔隙度有很好的關(guān)聯(lián)。在體內(nèi)植入任何異物都會(huì)不可避免地誘發(fā)入侵的巨噬細(xì)胞的極化，即iNOS陽(yáng)性的促炎癥巨噬細(xì)胞（M1）或CD206陽(yáng)性的抗炎癥巨噬細(xì)胞（M2）。植入4周后，這些標(biāo)記物的免疫熒光染色證實(shí)，CD206和iNOS陽(yáng)性細(xì)胞分布在整個(gè)通道支架的微通道內(nèi)（圖8D）。相比之下，巨噬細(xì)胞主要分布在非通道式支架的外圍邊界區(qū)域。圖像分析進(jìn)一步顯示，通道化支架中CD206陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量明顯高于非通道化對(duì)照組，而通道化支架中iNOS陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量與對(duì)照組支架接近。這些數(shù)據(jù)表明，通道化的SF支架具有更好的免疫調(diào)節(jié)和生物相容性。到目前為止，所有的結(jié)果都證明了通道式支架在通過(guò)鼓勵(lì)細(xì)胞化和血管化來(lái)促進(jìn)組織生長(zhǎng)方面的優(yōu)越性。

 

 

圖8. 在體內(nèi)植入各種有通道和無(wú)通道的SF支架以評(píng)估微通道對(duì)組織生長(zhǎng)的影響。A）實(shí)驗(yàn)裝置的示意圖，其中通道支架（支架A、B和C）或非通道支架（對(duì)照）被植入大鼠的皮下。B）皮下植入2周（Ba-i至Bd-i）和4周（Ba-ii至Bd-ii）后，外植體的H&E染色截面的代表性顯微鏡圖像。比例尺：200μm。#：通道的橫截面。黑色箭頭：新形成的組織。黃色箭頭：新形成的毛細(xì)血管。C）皮下植入2和4周后，不同支架內(nèi)組織生長(zhǎng)的半定量表征。(n≥5，*p＜0.05，**p＜0.001，NS：不顯著）。D) 對(duì)vWF（綠色）和DAPI（藍(lán)色）進(jìn)行免疫熒光染色后，新血管形成的外植體截面（Da-i至Dc-i）的代表性熒光圖像。炎癥性巨噬細(xì)胞（Da-ii至Dc-ii）在免疫熒光染色iNOS（紅色）和DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記后，以及抗炎性巨噬細(xì)胞（Da-iii至Dc-iii）在免疫熒光染色CD206（綠色）和DAPI（藍(lán)色）標(biāo)記后。比例尺。100 μm。 #：通道的橫切面。黃色箭頭：新形成的毛細(xì)血管。

 

最后，作者指出，PEC生物墨水和Pluronic F127支持基質(zhì)在嵌入式3D打印中的優(yōu)化組合可以確定幾個(gè)相關(guān)的創(chuàng)新，包括1）在高打印分辨率下形成復(fù)雜的多層結(jié)構(gòu)，2）相對(duì)較低的規(guī)模化障礙，以及3）制造過(guò)程中強(qiáng)大的容錯(cuò)性。分層通道網(wǎng)絡(luò)在體外和體內(nèi)表現(xiàn)出良好的通暢性，能促進(jìn)質(zhì)量交換以維持高細(xì)胞活力，并在皮下植入后促進(jìn)組織再生和整合。這樣的孔道支架將大大有利于生理相關(guān)組織的形成，可以用于體外測(cè)試組織模型或體內(nèi)重建手術(shù)。