剛剛，國家藥監(jiān)局器審中心發(fā)布《應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導(dǎo)原則 第三部分：生物相容性/毒理學(xué)評價（征求意見稿）》，全文如下：
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械安全性和有效性評價指導(dǎo)原則第三部分：生物相容性/毒理學(xué)評價
（征求意見稿）
一、背景
本指導(dǎo)原則為注冊申請人/監(jiān)管人員提供關(guān)于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評價相關(guān)方面的信息。
本指導(dǎo)原則是對應(yīng)用納米材料醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評價的一般要求，注冊申請人應(yīng)依據(jù)具體產(chǎn)品的特性對注冊申報資料的內(nèi)容進行充分說明和細化。注冊申請人還應(yīng)依據(jù)具體產(chǎn)品的特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細闡述理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。
本指導(dǎo)原則是對注冊申請人和審評人員的指導(dǎo)性文件，但不包括注冊審批所涉及的行政事項，亦不作為法規(guī)強制執(zhí)行，如果有能滿足相關(guān)法規(guī)要求的其它方法，也可以采用，但是需要提供詳細的研究資料和驗證資料。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標準體系以及當前認知水平下制定的，隨著法規(guī)和標準的不斷完善，以及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，本指導(dǎo)原則相關(guān)內(nèi)容也將進行適時的調(diào)整。
二、適用范圍
本指導(dǎo)原則適用于與人體直接或間接接觸，由納米材料組成或包含納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評價。
不適用于：
- 應(yīng)用納米材料的體外診斷（In Vitro Diagnosis，IVD）產(chǎn)品；
- 應(yīng)用納米材料的賦能技術(shù)（如納米機器人）；
- 應(yīng)用納米材料的藥品；
- 應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械在制造和廢棄過程中造成的職業(yè)和環(huán)境風險。
三、醫(yī)療器械中與納米材料相關(guān)的風險識別和風險評估的層級評價方法
本指導(dǎo)原則描述的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，是指注冊申請人在醫(yī)療器械產(chǎn)品中應(yīng)用了納米材料/納米結(jié)構(gòu)，且該納米材料/納米結(jié)構(gòu)被設(shè)計為發(fā)揮預(yù)期功能。此類醫(yī)療器械的生物學(xué)評價應(yīng)首先執(zhí)行GB/T 16886系列標準文件及醫(yī)療器械法律法規(guī)的內(nèi)容，再結(jié)合本指導(dǎo)原則描述的納米材料特殊考慮點進行相關(guān)研究。納米材料的安全風險與常規(guī)材料不同，主要取決于納米材料的化學(xué)成分、物理化學(xué)性質(zhì)、納米特性、納米結(jié)構(gòu)與形貌、與組織相互作用方式以及暴露途徑與水平等。相比于常規(guī)材料，納米材料在樣品制備時會有溶解性和分散性的區(qū)別，以及穩(wěn)定性和均一性的要求，因此可能需要考慮納米材料在樣品制備時的特殊性；由于納米材料被認為可能穿越所有生物屏障，包括血腦屏障和胎盤屏障等，因此可能需要考慮納米材料的全身毒性，特別是中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和生殖/發(fā)育毒性；“納米蛋白冠”的形成，可能會影響其生物響應(yīng)、動力學(xué)、蓄積和毒性等生理效應(yīng)；有些納米材料具有類佐劑特性，可能會對免疫系統(tǒng)產(chǎn)生影響，需要關(guān)注免疫毒性；納米材料被單核吞噬細胞系統(tǒng)清除、在特定組織器官分布、形成納米蛋白冠等可能改變其毒代動力學(xué)特征。因此，應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評價內(nèi)容，在兼顧GB/T 16886系列標準文件中關(guān)于常規(guī)器械評價內(nèi)容的基礎(chǔ)上，重點考慮與納米材料有關(guān)的其他問題，如樣品制備，吸收、分布、代謝和排泄/清除（ADME）、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性和免疫毒性等。對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械進行生物相容性/毒理學(xué)評價時，需根據(jù)GB/T 16886.1附錄A中描述的生物學(xué)評價框架開展評價，并參考ISO/TR 10993.22（等同轉(zhuǎn)化為GB/Z 16886.22）、本指導(dǎo)原則第四章及附錄一中所描述的納米材料特殊考慮點設(shè)計研究/試驗方案。
在對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械進行生物學(xué)評價時，如果納米材料吸收和分布導(dǎo)致納米材料的內(nèi)部暴露、反應(yīng)活性或代謝動力學(xué)或生物持久性發(fā)生改變時，可能觸發(fā)進一步的試驗，用于研究非常規(guī)的評價終點（如中樞神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)功能終點）。
為了生成有效的毒理學(xué)數(shù)據(jù)用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的風險識別和風險評估，更加高效地識別和評價特定風險，本指導(dǎo)原則提供了層級研究方法，用于逐步對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械中與納米材料相關(guān)的安全風險開展識別和評估。
層級1：如注冊申請人在醫(yī)療器械生產(chǎn)制造過程中使用了納米材料或納米結(jié)構(gòu)，且該納米材料或納米結(jié)構(gòu)預(yù)期在終產(chǎn)品中發(fā)揮作用，應(yīng)根據(jù)醫(yī)療器械已有信息和理化表征結(jié)果判斷終產(chǎn)品中是否有納米材料或納米結(jié)構(gòu)，若判斷無納米材料或納米結(jié)構(gòu)，則按照常規(guī)醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評價研究流程進行；若判斷有納米材料或納米結(jié)構(gòu)，則進行層級2的研究。目前，基于當前科學(xué)技術(shù)水平和認知，評估應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械中納米材料或納米結(jié)構(gòu)暴露可能性的評價方法和技術(shù)手段還不夠完善，若應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械中存在納米材料或納米結(jié)構(gòu)，難以排除無暴露的可能性，仍需通過生物相容性/毒理學(xué)評價來評估納米材料的安全風險。
層級2：主要針對常規(guī)評價終點進行研究/試驗，同時增加特殊指標的檢測，考察是否有潛在的特殊毒性風險，如免疫毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性等，來決定是否有必要進行深入研究。層級2的步驟如下：參考GB/T 16886.1附錄A選擇評價終點，并按照應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械評價要求設(shè)計試驗，具體參見本指導(dǎo)原則附錄一。GB/T 16886.1附錄A列出了一個制定生物學(xué)評價的框架，除適用于常規(guī)醫(yī)療器械外，也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。但由于納米材料或納米結(jié)構(gòu)可能引發(fā)非預(yù)期的生物學(xué)效應(yīng)，若已有信息或數(shù)據(jù)證明應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械在某些生物學(xué)評價終點有額外的安全風險考慮點，可在層級2增加相關(guān)研究內(nèi)容。因此，注冊申請人應(yīng)結(jié)合納米材料的納米特性及暴露特征，基于個案處理的原則，提供評價終點選擇的理由，并闡述評價終點選擇的科學(xué)性和合理性。
以下內(nèi)容為納米材料生物相容性與常規(guī)材料生物相容性研究差異性的舉例，具體內(nèi)容詳見附錄一：
? 細胞毒性：根據(jù)細胞攝取納米材料的能力，以及納米材料與細胞的相互作用模式考慮需增加的試驗。若常規(guī)細胞（如L929成纖維細胞）不足以代表納米材料在靶器官、接觸部位細胞、免疫細胞的攝取及生物效應(yīng)，應(yīng)考慮使用其他合適的細胞進行試驗，如肝、腎為潛在靶器官時，可選擇HepG2人源肝癌細胞、LLC-PK1豬腎近曲小管細胞、人源THP衍生巨噬細胞等進行試驗。
? 致敏反應(yīng)：若納米材料可穿透皮膚表層，僅進行GPMT試驗不足以評價納米材料的致敏反應(yīng)，可考慮增加體外替代方法并驗證方法的適用性，如直接肽反應(yīng)性測定法（DPRA）、人細胞系激活試驗（H-CLAT）、KeratinoSens和SenCeeTox等方法。
? 亞慢性全身毒性：根據(jù)層級評價方法，該試驗建議增加附加毒性終點相關(guān)檢測指標，如生殖系統(tǒng)毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌系統(tǒng)毒性等終點的相關(guān)敏感指標的檢測。
慢性毒性、致癌性、生殖/發(fā)育毒性、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性、免疫毒性、內(nèi)分泌干擾等附加毒性終點一般不作為層級2的首批評價終點，但需在層級2的其他試驗中增加與上述終點相關(guān)的敏感指標的檢測，作為進入層級3的依據(jù)，如在亞慢性全身毒性試驗中增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能觀察組合指標的檢測，考察應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械是否有潛在中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性。
若層級2的研究結(jié)果未發(fā)現(xiàn)附加毒性終點相關(guān)毒性指征的改變，一般無需進入層級3的研究，而是考察層級2的研究結(jié)果是否足以進行生物相容性/毒理學(xué)風險評估，若不足以進行生物相容性/毒理學(xué)風險評估，則需修正試驗條件重復(fù)層級2相關(guān)研究內(nèi)容，直至完成生物學(xué)評價，或根據(jù)研究結(jié)果停止生物學(xué)評價研究。
若層級2研究結(jié)果提示明確的附加毒性終點相關(guān)毒性指征，則進入層級3的研究。這些毒性指征包括但不限于納米材料存在消除緩慢、在特定的組織器官內(nèi)有蓄積的潛力、需要更長時間的代謝數(shù)據(jù)，或毒性特征提示需要關(guān)注特定組織/器官的毒性等。此外，若已有信息或數(shù)據(jù)證明應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械存在生殖系統(tǒng)毒性、免疫毒性等安全性風險時，需考慮直接進行層級3的相關(guān)研究。
層級3：是對層級2中發(fā)現(xiàn)的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械附加毒性終點相關(guān)毒性指征發(fā)生明顯改變時，開展與毒性指征相對應(yīng)的全面的特殊試驗，如生殖/發(fā)育毒性試驗、致癌性試驗、免疫毒性試驗、中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性試驗、或內(nèi)分泌干擾試驗等，參見本指導(dǎo)原則附錄一，同時考察關(guān)鍵組織、器官中納米材料暴露量、分布和蓄積特征。注冊申請人應(yīng)結(jié)合納米材料的納米特性及暴露特征，基于個案處理的原則，提供評價終點選擇的理由，并闡述評價終點選擇的科學(xué)性和合理性。
完成層級3的研究后，結(jié)合層級2和層級3的研究結(jié)果考察是否足以進行生物相容性/毒理學(xué)風險評估。若層級2、層級3的研究結(jié)果足以進行生物相容性/毒理學(xué)風險評估，不必再進行其他試驗；否則應(yīng)重復(fù)層級2或?qū)蛹?的相應(yīng)研究內(nèi)容，直至完成生物學(xué)評價，或根據(jù)研究結(jié)果停止生物學(xué)評價研究。
圖1 醫(yī)療器械中與應(yīng)用納米材料相關(guān)的風險識別和風險評估的層級評價方法流程圖
a. 現(xiàn)有GB/T 16886.1 附錄A，以及ISO/TR 10993.22所提供的框架用于評價應(yīng)用納米的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)是有限的，需要結(jié)合其納米特性和暴露特征考慮增加評價終點。
b. 如層級2研究結(jié)果提示應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械存在安全性風險，如蓄積、特定器官或系統(tǒng)毒性、則在層級3中針對層級2的發(fā)現(xiàn)進行進一步研究。如層級2中發(fā)現(xiàn)生殖器官有納米材料分布，應(yīng)在層級3中開展對生殖功能影響等毒性試驗。
c. 如果出現(xiàn)以下情況，需要考慮重復(fù)進行層級2或?qū)蛹?相關(guān)試驗研究，如完善試驗設(shè)計、試驗結(jié)果存在爭議、試驗結(jié)果提示需要補充研究內(nèi)容等。
d. 完成生物學(xué)評價后，可進行產(chǎn)品的獲益-風險評價，或者停止生物學(xué)評價，對產(chǎn)品重新進行研究和開發(fā)。
四、生物相容性/毒理學(xué)評價
（一）引言
對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)開展的評價包括文獻綜述、生物信息學(xué)、體外和體內(nèi)等一系列研究。對于醫(yī)療器械，任何試驗的選擇策略均基于其預(yù)期用途/適用范圍。體內(nèi)研究應(yīng)采用與醫(yī)療器械和/或納米材料人體暴露途徑相關(guān)的接觸途徑進行。所有試驗均應(yīng)按照現(xiàn)行/有效的最佳實驗室/治療規(guī)范進行，數(shù)據(jù)應(yīng)由經(jīng)過培訓(xùn)且有經(jīng)驗的專業(yè)人員進行分析解讀。對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生物相容性/毒理學(xué)評價應(yīng)依據(jù)以下原則：
1.進行多層級評價研究
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)測試策略由其潛在外部和內(nèi)部暴露特征決定。當理化表征及暴露評估確定醫(yī)療器械有納米材料或納米結(jié)構(gòu)暴露的可能性時，除按照GB/T 16886系列國家標準的要求進行相應(yīng)的試驗外，還應(yīng)基于納米材料風險評估的要求，參考ISO/TR 10993.22，按照與納米材料相關(guān)的風險識別和風險評估的層級評價方法流程圖進行多層級評價研究，考慮是否增加額外毒性關(guān)注指標，以及深入開展附加毒性試驗。
2.遵循個案處理原則
按照GB/T 16886.1的要求，醫(yī)療器械的生物學(xué)評價試驗策略均應(yīng)基于醫(yī)療器械分類、接觸性質(zhì)和暴露持續(xù)時間等進行考慮。由于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械情況復(fù)雜，本指導(dǎo)原則不可能涵蓋所有應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評價的全部內(nèi)容。針對某一具體產(chǎn)品，其生物相容性/毒理學(xué)評價應(yīng)遵循個案處理的原則。
3.確認測試系統(tǒng)的適用性
納米材料的溶解或分散狀態(tài)、樣品制備方法、劑量設(shè)計、細胞品系、動物種屬等測試系統(tǒng)參數(shù)都可能影響試驗結(jié)果的可靠性，故需確認測試系統(tǒng)是否適用于評價應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。目前可用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評價的專屬試驗方法尚在開發(fā)中，可參考的試驗方法較少，已發(fā)布并正式實施的相關(guān)標準主要包括內(nèi)毒素試驗（GB/T 41309、YY/T 1295）、細胞毒性試驗（GB/T 41212、GB/T 41915、YY/T 0993）、體外溶血試驗（YY/T 1532）。因此，注冊申請人應(yīng)確認測試系統(tǒng)的適用性，提供適合所申報產(chǎn)品特點的生物學(xué)評價資料。一些體外試驗可能對于篩選目的及作用機制的研究是有用的，但這些方法的使用必須基于個案處理原則。目前經(jīng)過確認的體外方法參見歐洲替代方法驗證中心（EURL ECVAM）發(fā)布的方法。
4.生物組織中納米材料的表征原則
納米材料和生物組織中的生物分子相互作用可能獲得新“生物學(xué)特征”，即在表面吸附蛋白質(zhì)等生物分子（蛋白冠、生物冠）時產(chǎn)生的新性質(zhì)，可影響機體的生理響應(yīng)及毒理學(xué)特征。因此，納米材料在試驗條件下的實際存在形式、特性和穩(wěn)定性等信息對于任何試驗結(jié)果的解釋都是至關(guān)重要的。應(yīng)在試驗開始和結(jié)束時（若可行）對生物組織中的納米材料進行表征。
5.毒代動力學(xué)數(shù)據(jù)判定原則
證明納米材料在細胞和/或組織中有暴露是解釋研究結(jié)果的關(guān)鍵（特別是陰性結(jié)果），缺乏這類數(shù)據(jù)對得出最終結(jié)論可能造成很大的不確定性。因此，在技術(shù)可行的情況下，應(yīng)確定納米材料是否分布在組織或細胞的特定區(qū)域，明確在試驗系統(tǒng)中的暴露量。
（二）應(yīng)用納米材料醫(yī)療器械生物學(xué)評價試驗的核心關(guān)注點
1.樣品制備
溶解和分散：納米材料與溶解的化學(xué)物質(zhì)不同，通常為不溶或部分溶解的納米顆粒以混懸/分散和/或更大的團聚和聚集狀態(tài)存在。試驗介質(zhì)/制劑（及其成分）可能影響納米材料的特性和性能。當采用體內(nèi)或體外方法對不溶或部分溶解納米顆粒進行測試時，一定要重點考慮納米材料在介質(zhì)中的分散狀態(tài)。
樣品制備：取樣和樣品制備通常是整個分析過程中至關(guān)重要的步驟，也是結(jié)果不確定性的最大可能來源。納米材料樣品制備中的一個關(guān)鍵問題是顆粒的適當分散。目前尚無專門應(yīng)對納米材料樣品制備的標準文件，注冊申請人可參考GB/T 16886.12提供的樣品制備通用要求進行樣品制備。此外，建議注冊申請人對樣品制備的分散效率和穩(wěn)定性進行測試并記錄。
2.濃度/劑量
納米材料濃度/劑量可能在試驗期間因團聚、聚集、沉淀、與試驗介質(zhì)中其他物質(zhì)結(jié)合，或在玻璃/塑料容器上吸附而降低。為了確保在試驗期間使用的濃度/劑量可以保持穩(wěn)定，任何體內(nèi)、體外毒性試驗應(yīng)特別關(guān)注納米材料的團聚/聚集、解聚和重聚集行為，以及納米材料的不溶/部分溶解性質(zhì)，考察納米材料在試驗介質(zhì)中的穩(wěn)定性和均一性，以確保所用的納米材料的濃度/劑量與預(yù)期一致。
此外，在特定的試驗方法中，使用過高的濃度或劑量可能會改變納米材料的物理化學(xué)特性（如形成團聚體等次級粒子），導(dǎo)致吸收、毒性降低，甚至獲得與材料固有毒性無關(guān)的結(jié)果，如吸入研究中過度負荷劑量、遺傳毒性中過高濃度導(dǎo)致細胞毒性等。因此，應(yīng)避免使用過高的濃度或劑量。
3.劑量單位
常規(guī)材料通常使用重量或體積單位劑量進行檢測、表示以及風險評估（例如mg/kg，或mg/L）。然而，對于納米材料來說，潛在生物相互作用不直接依賴于分子的濃度或數(shù)量，而依賴于納米材料/納米物體本身。納米毒理學(xué)的劑量-反應(yīng)關(guān)系可能不是傳統(tǒng)的質(zhì)量或濃度單位，而是納米物體數(shù)量或納米材料/納米物體的總表面積。因此，使用比表面積或顆粒數(shù)量劑量單位描述劑量-反應(yīng)關(guān)系可能更加合適，也可使用納米材料表征中得出的其他參數(shù)來表示劑量。在合適的參數(shù)識別出來之前，重要的是描述不同的劑量度量，如質(zhì)量/體積濃度、顆粒數(shù)量濃度、比表面積等，為基于質(zhì)量的劑量換算成其他參數(shù)提供足夠的信息。
4.對試驗系統(tǒng)的干擾
內(nèi)毒素的干擾：納米材料分散體系中存在的內(nèi)毒素可能干擾試驗系統(tǒng)，并隨試驗系統(tǒng)的不同導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。
對基于光學(xué)試驗方法的干擾：納米材料可能與試驗系統(tǒng)或試劑相互作用，特別是在比色試驗中（例如用于細胞活性試驗的磺酰羅丹明B，或MTT）。另外，一些納米材料本身對光有散射/吸收，也可能干擾比色試驗測定。這些因素需要在使用比色方法時加以考慮。
與生物分子作用：試驗系統(tǒng)中的蛋白質(zhì)/生物介質(zhì)（如細胞因子）也可能吸附到納米材料表面，造成低響應(yīng)甚至是假陰性結(jié)果。
對于此類問題，建議增加合適的對照品或?qū)ΜF(xiàn)有方法進行調(diào)整。例如，納米材料已被證明可干擾基于四唑化合物的試驗，如MTS和MTT法的吸光度檢測?？稍谧x數(shù)前通過離心除去納米材料，以降低由納米材料產(chǎn)生的數(shù)據(jù)變異度。
5.可能的毒性機制
解離離子的毒性：一些金屬（銀）、金屬氧化物（氧化鋅）或無機非金屬/陶瓷材料在生物介質(zhì)中會（緩慢）溶解/降解，檢測的部分（或全部）毒性效應(yīng)可能都源于溶解/降解產(chǎn)生的離子。對于這類納米材料，應(yīng)在試驗之前和試驗期間測定溶解/降解的部分所占比例，并增加合適的離子形式對照組。
與尺寸相關(guān)的毒性：納米材料的毒性可能源自其尺寸效應(yīng)，易于進入生物系統(tǒng)，被炎性細胞吞噬，特別是巨噬細胞和多核嗜中性粒細胞。納米材料可吸附蛋白質(zhì)和多肽形成新的蛋白質(zhì)復(fù)合物，或改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，促進蛋白質(zhì)降解，觸發(fā)炎性細胞的應(yīng)答過程。因此，應(yīng)關(guān)注尺寸效應(yīng)與毒性的相關(guān)性，以進行風險評估。
納米材料形貌對吞噬作用的影響：納米材料的軟硬度、剛性、拓撲結(jié)構(gòu)對細胞攝取、細胞內(nèi)定位、細胞內(nèi)吞機制均具有影響。例如，球狀納米顆粒被細胞內(nèi)吞的過程比棒狀或纖維狀納米材料容易和迅速。對于這類納米材料，應(yīng)關(guān)注不同納米形貌結(jié)構(gòu)對細胞攝取與毒性的影響。
（三）生物相容性/毒理學(xué)試驗
本指導(dǎo)原則旨在為經(jīng)過培訓(xùn)的專業(yè)人員提供在醫(yī)療器械評價方面對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械進行生物相容性/毒理學(xué)評價的通用方法，并在附錄一中討論如何基于GB/T 16886系列標準文件、ISO/TR 10993.22，及應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械特殊考慮點來設(shè)計試驗，包括試驗設(shè)計、細胞/動物模型選擇、研究終點選擇、結(jié)果解釋等內(nèi)容。
本指導(dǎo)原則代表了現(xiàn)有認知水平下監(jiān)管部門對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評價終點的考慮及應(yīng)對措施，未來隨著毒理學(xué)和納米材料轉(zhuǎn)歸方面的認知增長，更多試驗方法的缺陷可能會顯現(xiàn)出來，本指導(dǎo)原則的內(nèi)容將隨著納米材料生物相容性/毒理學(xué)評價研究的不斷推進而完善。因此，建議注冊申請人關(guān)注研究最新進展，并在開展應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)評價時加以考慮，以保持對應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物學(xué)評價最新技術(shù)的持續(xù)更新。
五、參考文獻
1. 歐盟新興與新識別健康風險委員會《醫(yī)療器械中應(yīng)用的納米材料潛在健康效應(yīng)指導(dǎo)原則》Guidance on the Determination of Potential Health Effects of Nanomaterials Used in Medical Devices, Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks （SCENIHR）2015
2. ISO/TR 10993.22: 2017（等同轉(zhuǎn)化為GB/Z 16886.22）醫(yī)療器械生物學(xué)評價第22部分：納米材料指南
3. GB/T 16886.1-2022醫(yī)療器械生物學(xué)評價第1部分：風險管理過程中的評價與試驗
4. 歐洲替代方法驗證中心（EURL ECVAM）：
https://joint-research-centre.ec.europa.eu/eu-reference-laboratory-alternatives-animal-testing-eurl-ecvam/alternative-methods-toxicity-testing/validated-test-methods-health-effects_en
5. GB/T 16886.12-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價第12部分：樣品制備與參照材料
6. GB/T 16886.5-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價第5部分：體外細胞毒性試驗
7. YY/T 0993-2015醫(yī)療器械生物學(xué)評價納米材料：體外細胞毒性試驗(MTT試驗和LDH試驗)
8. ASTM E2526-08（2013） Standard Test Method for Evaluation of Cytotoxicity of Nanoparticulate Materials in Porcine Kidney Cells and Human Hepatocarcinoma Cells
9. GB/T 16886.3-2019醫(yī)療器械生物學(xué)評價第3部分：遺傳毒性、致癌性和生殖毒性試驗
10. YY/T 0870.3-2019 醫(yī)療器械遺傳毒性試驗第3部分:用小鼠淋巴瘤細胞進行的TK基因突變試驗
11. OECD 476 In vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test
12. YY/T 0870.6-2019 醫(yī)療器械遺傳毒性試驗第6部分:體外哺乳動物細胞微核試驗
13. YY/T 0870.2-2019 醫(yī)療器械遺傳毒性試驗第2部分:體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗
14. YY/T 0870.4-2014醫(yī)療器械遺傳毒性試驗第4部分：哺乳動物骨髓紅細胞微核試驗
15. YY/T 0870.5-2014 醫(yī)療器械遺傳毒性試驗第5部分哺乳動物骨髓染色體畸變試驗
16. OECD 489 In vivo Mammalian Alkaline Comet Assay
17. OECD 483 Mammalian Spermatogonial Chromosomal Aberration Test
18. OECD 488 Transgenic Rodent Somatic and Germ Cell Gene Mutation Assays
19. GB/T 16886.11-2021醫(yī)療器械生物學(xué)評價第11部分：全身毒性試驗
20. GB/T 21804-2008 化學(xué)品急性經(jīng)口毒性固定劑量試驗方法
21. GB/T 21757-2008 化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗急性毒性分類法
22. GB/T 21826-2008 化學(xué)品急性經(jīng)口毒性試驗方法上下增減劑量法
23. GB/T 21605-2008 化學(xué)品急性吸入毒性試驗方法
24. GB/T 28648-2012 化學(xué)品急性吸入毒性試驗急性毒性分類法
25. GB/T 21606-2022 化學(xué)品急性經(jīng)皮毒性試驗方法
26. GB/T 21604-2008 化學(xué)品急性皮膚刺激性/腐蝕性試驗方法
27. GB/T 16886.10-2017醫(yī)療器械生物學(xué)評價第10部分：刺激與皮膚致敏試驗
28. OECD 430 In vitro Skin Corrosion Transcutaneous Electrical Resistance Test (TER)
29. OECD 431 In vitro Skin Corrosion: Reconstructed Human Epidermis (RhE) Test Method
30. GB/T 16886.4-2022醫(yī)療器械生物學(xué)評價第4部分：與血液相互作用試驗選擇
31. YY/T 1532-2017 醫(yī)療器械生物學(xué)評價納米材料溶血試驗
32. GB/T 16886.16-2021醫(yī)療器械生物學(xué)評價第16部分：降解產(chǎn)物與可瀝濾物毒代動力學(xué)研究設(shè)計
33. YY/T 1295-2015 醫(yī)療器械生物學(xué)評價納米材料：細菌內(nèi)毒素試驗
34. GB/T 16886.6-2022醫(yī)療器械生物學(xué)評價第6部分：植入后局部反應(yīng)試驗
35. OECD 421 Reproductive toxicity screening test
36. OECD 414 Prenatal Developmental Toxicity Test
37. OECD 415 One Generation Reproduction Toxicity Study
38. OECD 416 Two Generation Reproduction Toxicity Study
39. OECD 422 Combined Repeated Dose Toxicity Study
40. Guidance on risk assessment of the application of nanoscience and nanotechnologies in the food and feed chain: Part 1, human and animal health
41. 納米藥物非臨床安全性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）
42. 藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則
43. ISO/TR 22019:2019 Nanotechnologies—Considerations for performing toxicokinetic studies with nanomaterials
44. ICH S1B 藥物致癌性試驗
45. ICH S5(R3) 人用藥物生殖與發(fā)育毒性檢測
六、編寫單位
本指導(dǎo)原則由國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心牽頭，國家納米科學(xué)中心、廣東粵港澳大灣區(qū)國家納米科技創(chuàng)新研究院、山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院、中國食品藥品檢定研究院參與編寫，由國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心負責解釋。
附錄一 應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械生物相容性/毒理學(xué)研究相關(guān)內(nèi)容
（一）細胞毒性試驗
作為生物相容性/毒理學(xué)評價的一部分，細胞毒性試驗的結(jié)果可以作為納米材料潛在暴露和危害的證據(jù)，并確定其作用機制，有助于體內(nèi)試驗的設(shè)計和解釋?？砂凑誈B/T 16886.5、YY/T 0993和ASTM E2526的要求，根據(jù)已有的數(shù)據(jù)和暴露信息合理開展應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的細胞毒性試驗。
納米材料的細胞毒性依賴于細胞對其敏感性、特定受體的存在或攝取機制。納米材料可通過氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細胞毒性，并在進入細胞后與細胞內(nèi)不同成分相互作用并干擾細胞功能。此外，納米材料也可能通過離子釋放引起細胞毒性。根據(jù)應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的預(yù)期接觸部位和可能接觸的細胞類型，一般可選擇非吞噬性細胞（如3T3小鼠成纖維細胞，L929小鼠成纖維細胞，HaCaT人源角質(zhì)形成細胞）和/或吞噬性細胞（如RAW264.7 小鼠巨噬細胞，THP-1人源已分化巨噬細胞）進行試驗。為了獲得納米材料的危害和作用模式信息、以及暴露情況，鼓勵注冊申請人在能力可及范圍內(nèi)測試有代表性的靶組織部位細胞、接觸部位細胞、免疫細胞等類型。
可以考慮的特定終點包括細胞活力/細胞毒性（MTS、LDH法）、氧化應(yīng)激反應(yīng)、DNA合成（BrdU法）、能量代謝（測定ATP）、（促）炎癥反應(yīng)（作為免疫毒性的一部分）和組織屏障穿透性等。
（二）遺傳毒性試驗
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的遺傳毒性試驗應(yīng)遵循醫(yī)療器械GB/T 16886.1、GB/T 16886.3的一般性原則，同時考慮納米材料的特性。
納米材料可通過直接與DNA相互作用、干擾有絲分裂過程等產(chǎn)生遺傳毒性，還可通過氧化應(yīng)激反應(yīng)在細胞外引起遺傳物質(zhì)損傷，產(chǎn)生間接的遺傳毒性。所有的遺傳毒性試驗應(yīng)始終包括對納米材料在靶細胞/器官的暴露情況的評估。
1. 體外遺傳毒性試驗項目選擇
在考慮應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的體外遺傳毒性試驗組合時，應(yīng)考慮的遺傳毒性終點包括基因突變、染色體結(jié)構(gòu)或數(shù)目畸變。因此，推薦的體外遺傳毒性試驗組合如下：
（1）哺乳動物細胞基因突變試驗（如YY/T 0870.3小鼠淋巴瘤tk基因突變試驗、OECD 476 CHO/HGPRT突變試驗）。
（2）體外微核試驗（YY/T 0870.6）或體外染色體畸變試驗（YY/T 0870.2）
可以根據(jù)已獲得的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械相關(guān)信息，分別從以上兩項目中任選一個試驗進行組合，并提供科學(xué)判斷。
2. 體外遺傳毒性試驗注意事項
（1）由于細菌細胞壁的屏障效應(yīng)及缺乏內(nèi)吞作用影響細菌對納米材料的攝取，可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果，而且部分納米材料具有抑菌作用。因而，Ames試驗不是研究納米材料遺傳毒性的推薦方法。對于可誘導(dǎo)產(chǎn)生活性氧的納米材料，細菌回復(fù)突變試驗仍可能提供有用信息。“改良的Ames波動試驗”可能適合用于納米材料的遺傳毒性評價。
（2）在選擇最合適的哺乳動物細胞試驗系統(tǒng)進行體外遺傳毒性試驗時，細胞對納米材料的攝取能力是研究其代謝動力學(xué)和毒性的關(guān)鍵。因此建議使用可攝取納米材料且p53功能完整的細胞系開展體外遺傳毒性試驗，同時對細胞攝取能力進行分析。
（3）細胞松弛素B（cytochalasin B, CytoB）可干擾細胞骨架的形成，抑制細胞內(nèi)吞納米材料。因此體外微核試驗中必須延遲向納米材料處理的細胞培養(yǎng)物中加入Cyto B，從而保證納米材料與細胞培養(yǎng)系統(tǒng)充分暴露。
（4）體外微核試驗中，考慮到顆粒物進入細胞核的可能性較低，以及在有絲分裂過程中，為了促進核膜溶解后納米材料與DNA的接觸，建議處理時間覆蓋兩個細胞周期（至少為24小時），以保證納米材料與遺傳物質(zhì)（直接或間接）充分地接觸。
（5）體外微核試驗中，采用高濃度納米材料進行試驗時，細胞中的納米顆粒聚集體可能被誤認為是微核碎片，干擾微核識別和細胞分裂阻滯增殖指數(shù)的評價?？煽紤]使用熒光標記DNA探針進行組織學(xué)染色來減少干擾。
（6）大多數(shù)難溶性納米材料不會被代謝。然而，有些有機納米材料、涂覆有機官能團的無機納米材料在有和無代謝活化系統(tǒng)（S9）存在下的遺傳毒性表現(xiàn)出差異。因此，試驗中S9的使用應(yīng)該遵循個案處理原則。
3. 體內(nèi)遺傳毒性試驗
如果至少有一項體外遺傳毒性試驗結(jié)果陽性，在影響因素識別、化學(xué)表征以及證據(jù)權(quán)重判定浸提液或化合物有潛在遺傳毒性風險時，應(yīng)選擇適宜的體內(nèi)試驗評價遺傳毒性。如果體外試驗不適合測試納米材料（如所用分散介質(zhì)與體外培養(yǎng)系統(tǒng)不相容），可考慮開展體內(nèi)遺傳毒性試驗，除非能充分證明體外陽性結(jié)果與體內(nèi)情況無關(guān)。
需要注意的是，納米材料誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以產(chǎn)生活性氧自由基，可能觸發(fā)二次遺傳毒性，體外試驗系統(tǒng)卻無法檢測。若納米材料存在這樣的效應(yīng)，建議在全身毒性試驗中結(jié)合體內(nèi)彗星試驗評價遺傳毒性。
選擇適當?shù)捏w內(nèi)遺傳毒性試驗需要基于現(xiàn)有信息進行專業(yè)判斷，應(yīng)與體外試驗中已識別出的遺傳毒性終點，以及合適的靶器官或組織、暴露情況相關(guān)聯(lián)，并根據(jù)體外試驗的結(jié)果逐步進行。在缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)的情況下，如納米材料沒有到達靶組織，則相應(yīng)試驗方法不適用于檢測遺傳毒性。因此，以下任一體內(nèi)遺傳毒性試驗可能是合適的：
? 體內(nèi)微核試驗（YY/T 0870.4）
? 體內(nèi)哺乳動物骨髓染色體畸變試驗（YY/T 0870.5）
? 體內(nèi)彗星試驗（OECD 489）
? 體內(nèi)精原細胞染色體畸變試驗（OECD 483）
? 轉(zhuǎn)基因嚙齒動物基因突變試驗（OECD 488）
目前針對常規(guī)材料遺傳毒性試驗在納米材料中的應(yīng)用驗證在不斷開展中，故在本指導(dǎo)原則框架下，在開展遺傳毒性試驗前，應(yīng)將此類進展考慮在內(nèi)。
（三）急性毒性
醫(yī)療器械急性毒性試驗相關(guān)標準（GB/T 16886.11、GB/T16886.12）的一般要求也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。樣品制備時，應(yīng)說明分散體系選擇的合理性。GB/T 16886.11以外的急性毒性試驗信息可以在下面找到：急性經(jīng)口毒性試驗固定劑量法（GB/T 21804），急性毒性分類方法（GB/T 21757），或者上下增減劑量法（GB/T 21826）。吸入途徑急性毒性分級方法在GB/T 21605和GB/T 28648中描述，體內(nèi)急性皮膚毒性試驗在GB/T 21606及 GB/T 21604中描述。
（四）刺激性
納米材料的生物效應(yīng)可能導(dǎo)致其穿透皮膚、眼睛或黏膜以及被攝取，應(yīng)考慮適宜的模型評價納米材料的刺激性。GB/T 16886.10 的一般要求也適用于納米材料。此外，當局部組織生理狀態(tài)改變時，如分泌汗液的皮膚、機械損傷的表面、病理學(xué)病癥、光損傷等，對納米材料的屏障效應(yīng)也可能發(fā)生相應(yīng)改變，導(dǎo)致不同的刺激性。因此，選擇的試驗方法應(yīng)能充分模擬應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的臨床具體使用條件和暴露途徑。
雖然已有一些體外替代試驗（如大鼠皮膚經(jīng)皮電阻抗試驗，OECD 430；EpiSkin™, EpiDerm™, SkinEthic™, EST-1000，OECD 431）被驗證用于評價化學(xué)品的刺激性，但無證據(jù)證明當前的替代試驗適用于評價納米材料。若注冊申請人采用體外替代方法進行刺激性試驗時，需要提供詳細的研究資料和驗證資料。關(guān)于體外替代方法的相關(guān)內(nèi)容，將在本系列指導(dǎo)原則第五部分：體外替代測試方法/計算機模擬研究中給出。
（五）皮膚致敏反應(yīng)
納米材料的大比表面積，類佐劑效應(yīng)以及與蛋白質(zhì)形成的復(fù)合物都可能會導(dǎo)致過敏。GB/T 16886.10描述了評估醫(yī)療器械及其成分誘發(fā)皮膚致敏反應(yīng)的試驗方法，即鼠科動物局部淋巴結(jié)測定（LLNA）、豚鼠最大劑量試驗（GPMT），以及封閉式貼敷試驗。但這些試驗對納米材料的適用性有待驗證。由于納米材料的低皮膚穿透性，LLNA和/或封閉式貼敷試驗可能檢測不出致敏潛力，陰性試驗結(jié)果不能被解釋為納米材料無致敏性。GPMT由于首次誘導(dǎo)為皮內(nèi)途徑，可能是目前檢測納米材料致敏性最相關(guān)的試驗，盡管局部誘導(dǎo)期和激發(fā)均使用完整皮膚進行。
目前，采用GPMT試驗評價納米材料的實驗數(shù)據(jù)非常有限?；诂F(xiàn)有知識，不能依賴單一特定的試驗方法來研究納米材料。而且，這些試驗僅用于測試皮膚致敏反應(yīng)，尚未見評價由免疫球蛋白E介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng)的方法的報道。
（六）血液相容性
目前缺乏專用于評價與血液直接或間接接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械血液相容性的標準方法，體外條件下的溶血、血液學(xué)、凝血、血小板激活和補體激活試驗均可以為納米材料血液相容性提供有效的參考。
對于表面具有納米材料/納米特征的醫(yī)療器械，可直接按照GB/T 16886.4開展血液相容性評價，推薦以器械表面積/血液體積的比例計算接觸體系。由于游離納米材料比常規(guī)材料有更高的比表面積，其血液相容性評價更具有挑戰(zhàn)性，在參考GB/T 16886.4、YY/T 1532進行試驗時，需特別關(guān)注納米材料特性對其進入血液后的級聯(lián)反應(yīng)的影響，以及納米材料在介質(zhì)中的表征結(jié)果。
若體外試驗不足以評價納米材料的血液相容性，可考慮結(jié)合體內(nèi)試驗進行評價，將納米材料注射到循環(huán)系統(tǒng)并評價其分布以及任何局部和全身不良反應(yīng)，如血管損害、血液學(xué)、血生化相關(guān)指標的改變，并參考GB/T 16886.4進行補體激活、凝血級聯(lián)激活、血小板激活等試驗評價納米材料的血液相容性。
補體系統(tǒng)通過材料的調(diào)理作用，參與針對非自身實體的先天性免疫防御，從而令巨噬細胞對納米材料進行識別和攝取。因此，除了血液相容性常規(guī)項目外，建議考慮納米材料與吞噬細胞的潛在相互作用。目前尚無評價納米材料與吞噬細胞相互作用的標準方法。推薦增加內(nèi)皮細胞和/或單核細胞激活評估（如評價細胞黏附分子標志物、促炎因子、促凝因子等）。
此外，新技術(shù)（如微流控）可能用于評價納米材料與內(nèi)皮細胞和/或血管的相互作用。
（七）毒代動力學(xué)
1. 引言
納米材料受其尺寸、表面性質(zhì)和形狀等理化性質(zhì)的影響，與常規(guī)材料相比，轉(zhuǎn)運模式及代謝動力學(xué)特征均可能發(fā)生明顯變化。如果從醫(yī)療器械中釋放的納米材料可能被吸收、分布、代謝和/或排泄，即需要進行毒代動力學(xué)研究。
醫(yī)療器械接觸途徑可能影響納米材料的動力學(xué)特征，因此需要重點關(guān)注。如當氣管內(nèi)接觸金納米顆粒（1.4 nm）時，腎顯示出比肝更高的暴露量，而采用靜脈接觸后，肝成為最主要的靶器官。
納米材料的釋放動力學(xué)可能受到納米材料表面分子粘附的影響。蛋白分子可能附著于納米材料表面形成蛋白冠，并促進單核巨噬細胞系統(tǒng)（MPS）對納米材料的識別和攝取。局部組織中的納米材料主要通過淋巴遷移或轉(zhuǎn)運至循環(huán)系統(tǒng)，也可能被吞噬細胞吞噬和二次組織分布，最終到達其他組織器官，如脾、肝等。
2. 逐級進行毒代動力學(xué)研究
基于風險評估的目的，以及提高效率、減少實驗動物的使用，并提供更好的數(shù)據(jù)，推薦逐級進行毒代動力學(xué)（ADME）研究，對納米材料進行暴露表征和暴露評估。
（1）收集特定納米材料以及類似材料（如非納米材料）的現(xiàn)有信息，包括與吸收/生物利用度、分布模式和清除相關(guān)的信息。
（2）在生物學(xué)評價/毒理學(xué)評價層級2的亞慢性毒性試驗中增加衛(wèi)星組進行毒代動力學(xué)研究，以研究納米材料是否會蓄積以及蓄積到何種程度。建議注冊申請人在研究結(jié)束后及一段消除期后檢測納米材料的組織分布。任何組織中暴露量的顯著增加，或在消除期間的緩慢釋放，都應(yīng)進行討論，并在層級3中進一步評估。若對試驗方案的劑量、濃度、代謝動力學(xué)等研究內(nèi)容的設(shè)計存在疑慮時，可在亞急性毒性試驗中伴隨進行單次及多次暴露的毒代動力學(xué)研究，初步獲得納米材料的吸收、分布、蓄積和消除特征，避免在后續(xù)步驟中使用過高毒性劑量。
（3）在層級3中需要進行深入的毒代動力學(xué)研究，以評估重復(fù)接觸的效應(yīng)，以及重復(fù)接觸是否會導(dǎo)致納米材料的暴露量達到穩(wěn)態(tài)或在體內(nèi)蓄積，并覆蓋納米材料暴露量達到穩(wěn)態(tài)的時間點。必要時，可能需要伴隨其他試驗研究生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等特定系統(tǒng)的暴露情況，如伴隨生殖/發(fā)育毒性試驗開展毒代動力學(xué)研究，對胎盤、乳汁中的納米材料進行定性和定量分析。
3. 納米材料毒代動力學(xué)研究方法
GB/T 16886.16的一般性原則也適用于應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械。與常規(guī)材料不同的是，器官可能快速攝取納米材料而不依賴于其在血液中的濃度，即使血液中的濃度很低，器官對納米材料的攝取也可能發(fā)生。納米材料在組織中的分布、蓄積以及消除可能比在血漿中的暴露特征更能代表真實的暴露情況，尤其是在典型的攝取器官、靶器官中的分布情況，如肝、脾、肺等。多次接觸會導(dǎo)致納米材料蓄積，特別是靜脈接觸后，在肝和脾中蓄積非常明顯，這可能導(dǎo)致納米材料在器官中長期保留。此外，腎可能是納米材料排泄的重要器官。為了識別納米材料的組織分布、蓄積和滯留潛力，有必要設(shè)計單次和多次接觸的毒代動力學(xué)研究，并合理延長樣本采集時間點。
目前，對生物樣品中的納米材料進行定量分析的方法有限。現(xiàn)有的檢測方法中，金屬納米顆粒相比于其他納米材料更容易被檢測，且絕大多數(shù)納米材料毒代動力學(xué)研究采用元素分析法對納米材料化學(xué)組成進行定量分析。定量分析方法可以采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）或原子吸收光譜-質(zhì)譜法（AAS-MS）等。但檢測出特定的元素并不能證明材料以納米形式存在。可考慮采用單顆粒ICP-MS技術(shù)檢測生物樣品中的納米材料。具體研究時，建議先采用定量分析方法對組織中的元素進行檢測，若有特征元素存在，再采用納米材料特異性的方法進行定性分析，考察化合物是否以納米形式存在。關(guān)于生物樣品中納米材料的理化表征方法，請參考本系列指導(dǎo)原則第二部分：理化表征。
放射性同位素或熒光染料標記方法可用于標記納米材料，跟蹤納米材料的生物轉(zhuǎn)化和生物轉(zhuǎn)運過程。通過將標記添加到納米材料中形成特定結(jié)合或利用納米材料本身的放射性同位素可實現(xiàn)納米材料的標記。但某些標記可以從納米材料中脫離，干擾毒代動力學(xué)研究。因此，當使用任何特定的標記技術(shù)時，需要仔細評估標記-納米材料組合的完整性，分別測定生物樣品中母體物質(zhì)和代謝物的總量。
標記方法可能引起納米材料的表面化學(xué)變化，并影響其物理化學(xué)性質(zhì)，以及毒代動力學(xué)特征和毒性。而且，放射性標記納米材料具有可用性和安全性問題。因此，納米材料的標記方法受到限制。尤其是在吸入毒性試驗中，使用放射性標記的納米材料可能造成設(shè)備的污染。當使用標記的納米材料進行毒代動力學(xué)研究時，需要注意以下問題：
（1）確保在接觸和進入體內(nèi)后標記按預(yù)期發(fā)揮作用；
（2）確保標記不會改變納米材料的毒代動力學(xué)行為。
4. 經(jīng)皮膚接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的毒代動力學(xué)
評估醫(yī)療器械的皮膚穿透性可以采用多種哺乳動物模型，以及體外人體皮膚模型，但目前沒有專用于評價應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的模型。研究的難點之一是納米材料的定量分析。一般來說，納米材料穿透皮膚角質(zhì)層的能力有限，然而，仍有一些納米材料存在有限的攝取。例如納米銀敷料與體外皮膚模型接觸后，檢驗血液中有低水平的銀元素轉(zhuǎn)移。影響皮膚穿透和吸收的因素包括皮膚損傷，如擦傷和UVB損傷（曬傷），機械壓力（皮膚撓曲），以及溶劑和載體效應(yīng)。
5. 非經(jīng)皮膚接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的毒代動力學(xué)
（1）眼暴露攝入
納米材料可能用于接觸鏡，以增強藥物在眼中的攝入和靶向性，材料的納米特性可能在使用后消失。然而，沒有關(guān)于納米材料在眼部的釋放和代謝動力學(xué)數(shù)據(jù)。有報道表明含有甲殼素的納米凝膠穿透到了豬角膜的更深部位，沒有破壞角膜細胞和引起炎癥反應(yīng)。
（2）吸入暴露攝入
納米材料經(jīng)吸入途徑暴露后（如與齒科操作相關(guān)），雖然大多數(shù)納米材料保留在肺部，但仍有一小部分納米材料可在全身被檢測到。納米材料從肺部清除的半衰期可能高達2個月。黏膜纖毛對肺部吸入顆粒的清除，可導(dǎo)致部分納米材料進入胃腸道（GI-tract），并經(jīng)糞便排泄。黏膜纖毛的清除和糞便排泄，是機體清除吸入納米材料的主要途徑。納米材料粒徑影響其在呼吸系統(tǒng)中的暴露部位，一般來說小尺寸（7 nm比20 nm）納米顆粒有更高的肺部攝入，甚至特定尺寸納米材料能通過嗅覺神經(jīng)遷移至大腦。
（3）經(jīng)口暴露攝入
與常規(guī)材料相比，納米材料經(jīng)口途徑暴露的量通常較低，小尺寸納米材料有更高的攝入量，粒徑>100 nm的顆粒也可能被胃腸道吸收?？梢允褂梦改c道體外模型來研究納米材料在腸道細胞的轉(zhuǎn)運。例如使用Caco-2細胞常用的Transwell細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。也可以使用胃腸道模型預(yù)測顆粒在體內(nèi)的吸收。
（4）皮下暴露攝入（植入物）
應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械植入皮下后，可能在局部釋放少量納米材料。因此可以通過皮下注射作為經(jīng)皮植入分布研究替代方法。應(yīng)關(guān)注納米材料在淋巴結(jié)、肝、脾和肺等器官的顆粒團聚現(xiàn)象。
（八）熱原
由于納米材料表面極易吸附微生物及其產(chǎn)生的細菌內(nèi)毒素（LPS），干擾納米材料與生物系統(tǒng)之間的相互作用，增加熱原反應(yīng)風險。應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械細菌內(nèi)毒素檢測可參考YY/T 1295給出的試驗方法進行。除細菌內(nèi)毒素介導(dǎo)的致熱性外，也需考慮納米材料介導(dǎo)的致熱性，可參考GB/T 16886.11給出的試驗方法進行測試。
（九）植入
GB/T 16886.6中提供了不同組織（皮下、肌肉、骨、腦）局部植入的標準方法，也適用于降解和非降解納米材料、固體和非固體納米材料如多孔材料、液體、凝膠、膏狀和粉末等不同形態(tài)。
對于非降解納米材料，組織反應(yīng)通常在12周后可達到穩(wěn)定狀態(tài)，而對于可降解材料，組織反應(yīng)的穩(wěn)定狀態(tài)通常取決于納米材料在組織中的降解特性。納米材料在降解過程中可能與局部組織持續(xù)發(fā)生相互作用，故需要監(jiān)測更多的觀察周期以覆蓋典型的組織變化節(jié)點，還應(yīng)關(guān)注所產(chǎn)生納米顆粒在局部沉積引起的局部組織學(xué)效應(yīng)，以及向引流淋巴結(jié)遷移及進入血液引發(fā)全身效應(yīng)的風險。
盡管GB/T 16886.6不用于全身毒性、致癌性、致畸性或致突變性的評估，但如果在植入研究過程中，同步滿足了GB/T 16886.11全身毒性的要求，則可以進行局部反應(yīng)和全身反應(yīng)的聯(lián)合研究。
（十）亞慢性毒性試驗
GB/T 16886.11中提供了醫(yī)療器械在適當?shù)谋┞锻緩胶蜁r間的多次接觸毒性試驗方法。由于醫(yī)療器械涉及的材料類型多、形態(tài)復(fù)雜、預(yù)期用途范圍廣等特點，故在全身毒性試驗設(shè)計中應(yīng)根據(jù)納米材料的特性考慮特定的方法。
應(yīng)當考慮臨床預(yù)期用途/適用范圍、終產(chǎn)品狀態(tài)、暴露特征等因素，在最恰當?shù)臈l件下開展亞慢性毒性試驗，以便模擬人體暴露情況。如直接應(yīng)用終產(chǎn)品不可行，應(yīng)使用終產(chǎn)品的代表性樣品進行測試。
短期的亞慢性毒性試驗可提供初步的劑量探索和毒代動力學(xué)數(shù)據(jù)，用以發(fā)現(xiàn)重點關(guān)注的靶器官。對于經(jīng)血液接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，最低要求是改良的28天毒性試驗（伴隨毒代動力學(xué)研究），對于其他途徑接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，最低要求是改良90天毒性試驗（伴隨毒代動力學(xué)研究），并應(yīng)根據(jù)所研究的納米材料特性，評估28天或90天試驗是否足夠。在該試驗中，除了關(guān)注一般全身毒性反應(yīng)外，還應(yīng)重點關(guān)注心血管系統(tǒng)（如納米尺度團聚物在血管內(nèi)形成）、炎癥指標、涉及吞噬系統(tǒng)的組織/器官（如肝、脾、腎、骨髓和肺等），以及需要盡可能評估納米材料的潛在神經(jīng)毒性、免疫毒性、生殖毒性或內(nèi)分泌介導(dǎo)效應(yīng)，進行初步危害表征和危害評估，為風險評估提供信息，為進一步深入研究提供依據(jù)。與組織、器官存在長期、持久接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，需要重點關(guān)注接觸組織、器官的潛在毒性風險，如與生殖組織、胚胎或胎兒長期或持久接觸的應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械，可能需要重點關(guān)注潛在的生殖發(fā)育毒性風險。
（十一）需要附加考慮的試驗
1. 慢性毒性/致癌性試驗
慢性毒性和致癌性研究一般是在單一物種中進行，通常選擇大鼠，可以單獨進行研究，也可聯(lián)合進行研究。當首選物種出現(xiàn)可疑結(jié)果或者特定發(fā)現(xiàn)，或需要專門研究所觀察到的毒性或者致癌性的作用機制時，則需要進行第二個物種的致癌性研究。
GB∕T 16886.3描述了致癌性試驗，但沒有證據(jù)表明試驗對于納米材料的適用性。因而，開展試驗時必須基于個案處理的原則。應(yīng)在獲得應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械潛在暴露的基礎(chǔ)上闡明開展致癌性試驗的理由。
2. 生殖和發(fā)育毒性試驗
亞慢性毒性試驗可獲得應(yīng)用納米材料的醫(yī)療器械的生殖系統(tǒng)毒性信息，如對生殖器官、動情周期（如果需要）、性激素（如果需要）的影響等，但不能評估對生育力和整個生殖周期（從性成熟到受孕、妊娠、分娩和分娩后發(fā)育）的影響，即發(fā)育毒性。需根據(jù)層級2中改良亞慢性毒性試驗的毒性特征及暴露情況，綜合考慮是否在層級3中開展生殖和發(fā)育毒性試驗。
在缺乏證據(jù)可以排除生殖/發(fā)育風險的情況下，應(yīng)考慮進行多代生殖/發(fā)育毒性試驗和/或擴展一代生殖發(fā)育毒性試驗（EOGRTS）。
（1）多代生殖/發(fā)育毒性試驗
如果需要進行測試，應(yīng)按照OECD 421（生殖/發(fā)育毒性篩選試驗）提供關(guān)于生殖和/或發(fā)育的初始信息。如果基于篩選試驗結(jié)果需進行額外的試驗，應(yīng)按照OECD 414 （胎兒發(fā)育毒性試驗）, OECD 415 （一代生殖毒性試驗）, OECD 416 （二代生殖毒性試驗）或OECD 422 （重復(fù)給藥生殖/發(fā)育毒性篩選聯(lián)合試驗）開展試驗，并對方法的適用性進行個案處理。
（2）擴展一代生殖發(fā)育毒性試驗
結(jié)合了生殖/發(fā)育、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、免疫系統(tǒng)發(fā)育等數(shù)個毒性終點，可能包括額外的試驗，例如內(nèi)分泌研究、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育毒性和行為學(xué)研究，評估妊娠期、哺乳期和青春期前暴露對生育和生殖功能的短期到長期的影響，以及對離乳前仔代和離乳后仔代的影響。當需要充分表征人體暴露風險時，可能需要考慮EOGRTS評估到F2代。如果能提供足夠的關(guān)于神經(jīng)毒性和免疫毒性的信息（例如超過90天的試驗），可采用多代生殖和發(fā)育毒性試驗替代擴展一代生殖毒性試驗（EOGRTS）。
（3）生殖/發(fā)育毒性試驗注意事項
a.不推薦使用可能影響胎兒發(fā)育的暴露途徑。例如，腹膜內(nèi)接觸可能導(dǎo)致納米材料直接注射到子宮或穿過子宮壁，影響發(fā)育中的胚胎/胎兒。壓力環(huán)境及每天超過6小時不進食水，導(dǎo)致經(jīng)鼻吸入暴露途徑不適用于懷孕雌性動物。
b.在發(fā)育毒性研究中，納米材料可能經(jīng)母乳暴露于子代，故應(yīng)對母乳中納米材料進行表征。
3. 免疫毒性
免疫反應(yīng)在層級2的研究中可能會被擴大或首次出現(xiàn)，評價納米材料對免疫系統(tǒng)的作用可以基于層級2中的試驗結(jié)果對免疫毒性進行綜合評估，在個案處理原則上考慮層級3的試驗內(nèi)容。
在亞慢性和慢性毒性試驗中，通常提供血液學(xué)和血生化數(shù)據(jù)，以及脾細胞（T-、B-、NK細胞）和骨髓細胞的表型分析。EOGRTS試驗需設(shè)置額外的組用于評估暴露對免疫系統(tǒng)發(fā)育的潛在影響，并提供免疫球蛋白IgM對T細胞依賴抗原（如綿羊紅細胞(SRBC)或血藍蛋白 (KLH)）反應(yīng)的信息。
如果需要進一步評估納米材料的免疫毒性，可采用體外模型進行評估，可考慮評估免疫細胞的吞噬功能、趨化性、炎性因子、一氧化氮產(chǎn)生和信號通路等指標。
由于沒有單一的試驗方法能提供免疫毒性的決定性證據(jù)，因此建議采用證據(jù)權(quán)重方法綜合評估納米材料的免疫毒性風險。
4. 神經(jīng)毒性
納米材料的潛在神經(jīng)毒性信息可從改良的亞慢性毒性試驗中獲得，相關(guān)指標包括臨床體征的改變、功能性觀察組合試驗（FOB）和自主活動、腦臟器系數(shù)（在沒有明顯毒性的情況下），以及神經(jīng)系統(tǒng)組織病理學(xué)改變，如有必要，可增加神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)元結(jié)構(gòu)及炎癥因子等指標。其他如體外神經(jīng)毒性試驗、交叉參照或提示具有神經(jīng)毒性潛能的物理化學(xué)性質(zhì)等信息也應(yīng)予以綜合考慮。
層級2發(fā)現(xiàn)潛在神經(jīng)毒性時，應(yīng)基于個案處理原則考慮在層級3進行深入的神經(jīng)毒性試驗，從而確認或表征納米材料誘發(fā)的神經(jīng)毒性反應(yīng)。在設(shè)計這些研究時也應(yīng)充分考慮其他試驗的信息，以盡量減少全身毒性繼發(fā)的效應(yīng)。在完成風險評估時，還可以進行機制研究，以提高從動物到人體的外推把握度。
5. 內(nèi)分泌介導(dǎo)效應(yīng)
納米材料可能對內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生不利影響，特別是對生殖系統(tǒng)，可能改變激素水平，還可能具有性別差異。改良的亞慢性毒性試驗可用于研究內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。額外的參數(shù)應(yīng)關(guān)注內(nèi)分泌相關(guān)毒性終點（如甲狀腺激素的測定、與內(nèi)分泌系統(tǒng)相關(guān)的大體解剖檢查和組織病理學(xué)檢查）和動情周期的評估等。
京公網(wǎng)安備11010802046783號
