近期，西南交通大學(xué)的魯雄教授、謝超鳴研究員團(tuán)隊(duì)、四川大學(xué)的趙志河教授、王軍教授在科愛出版創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上聯(lián)合發(fā)表研究文章：針對在糖尿病條件下牙周骨組織修復(fù)困難的問題，本研究基于仿貽貝細(xì)胞粘附機(jī)理，開發(fā)了一種包含聚多巴胺還原氧化石墨烯（PGO）和聚多巴胺修飾羥基磷灰石納米顆粒（PHA）的電活性海藻酸鹽/明膠支架用于糖尿病牙周骨缺損的修復(fù)。PHA賦予支架骨誘導(dǎo)性，PGO為支架提供導(dǎo)電通路。電活性支架通過向干細(xì)胞傳遞內(nèi)源性電信號并激活Ca2+通道來促進(jìn)骨再生。此外，聚多巴胺的酚羥基通過糖酵解通路和RhoA/ROCK通路抑制M1巨噬細(xì)胞極化，激活M2巨噬細(xì)胞。由于支架的電活性、活性氧清除能力、抗炎和免疫調(diào)節(jié)能力協(xié)同作用，促進(jìn)了糖尿病牙周炎癥微環(huán)境中的牙槽骨缺損再生，為設(shè)計(jì)免疫調(diào)節(jié)生物材料治療免疫相關(guān)疾病和組織再生提供了一種新的策略。
研究內(nèi)容簡介
牙周炎是一種常見的慢性炎癥性疾病，可導(dǎo)致牙周組織破壞，主要包括牙槽骨缺損和牙齦萎縮。尤其在糖尿病條件下，糖尿病會加重炎癥，過度激活破骨細(xì)胞（加劇骨吸收），并通過降低促進(jìn)骨再生的生長因子表達(dá)來損害牙周炎中的骨偶聯(lián)。高水平的葡萄糖會觸發(fā)激活免疫細(xì)胞趨化因子的產(chǎn)生。長期炎癥狀態(tài)會誘導(dǎo)晚期糖基化終產(chǎn)物和活性氧的產(chǎn)生，從而導(dǎo)致局部牙周微環(huán)境中炎癥因子的過度表達(dá)。此外，糖尿病與M1型巨噬細(xì)胞的長時(shí)間極化有關(guān)，后者可誘導(dǎo)慢性炎癥。因此，局部免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)對于糖尿病患者的牙周骨再生非常重要。
貽貝啟發(fā)的聚多巴胺（PDA）被認(rèn)為是一種很有前途的抗氧化劑，通過清除活性氧和下調(diào)炎癥介質(zhì)來降低氧化應(yīng)激。據(jù)報(bào)道，PDA也具有免疫調(diào)節(jié)能力。該團(tuán)隊(duì)前期研究表明，基于PDA的導(dǎo)電絲纖維貼片通過促進(jìn)細(xì)胞粘附、減輕炎癥、緩解氧化應(yīng)激和重塑細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）來加速糖尿病傷口愈合。有趣的是，該導(dǎo)電貼片將電信號傳遞給細(xì)胞，傷口愈合的質(zhì)量得到了改善。同理，內(nèi)源性電信號也可促進(jìn)骨再生。
基于以上目的，本研究中該團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種導(dǎo)電海藻酸鈉/明膠（AG）支架，以調(diào)節(jié)糖尿病牙周炎癥微環(huán)境，促進(jìn)牙周骨缺損再生。PGO-PHA-AG復(fù)合支架的設(shè)計(jì)思路及其在牙周骨缺損中的修復(fù)機(jī)理如圖1所示：該支架包含PGO和PHA兩種納米顆粒（圖1a，b）。PDA的特性使PHA和PGO能夠很好地分散在AG網(wǎng)絡(luò)中，最終得到用于糖尿病牙周骨缺損的電活性支架（圖1c，d）。支架中的PGO提供了一條導(dǎo)電通路，使支架具有電活性。通過電活性，支架將內(nèi)源性電信號傳遞給細(xì)胞，從而激活細(xì)胞表面的鈣離子通道（圖1e）。PDA對細(xì)胞的粘附能力和ROS清除特性協(xié)同賦予支架免疫調(diào)節(jié)能力，即降低巨噬細(xì)胞的M1向極化以下調(diào)炎性因子的表達(dá)，并促進(jìn)巨噬細(xì)胞極化為M2型（圖1f）。最終PGO-PHA-AG復(fù)合支架的電活性和免疫調(diào)節(jié)能力協(xié)同促進(jìn)糖尿病牙周炎癥微環(huán)境中的牙槽骨缺損再生（圖1g）。
圖1 用于糖尿病牙周骨缺損再生的具有多功能特性的PGO-PHA-AG支架合成示意圖。（a）PHA合成示意圖。（b）PGO合成示意圖。（c）物理化學(xué)雙交聯(lián)PGO-PHA-AG支架網(wǎng)絡(luò)中的相互作用方式。（d）糖尿病牙周微環(huán)境中ROS、M1型巨噬細(xì)胞和炎性因子過度表達(dá)。（e）該支架促進(jìn)細(xì)胞粘附，將內(nèi)源性電信號傳遞給細(xì)胞，進(jìn)而激活鈣離子通道。（f）PDA的細(xì)胞粘附能力和ROS清除能力賦予支架免疫調(diào)節(jié)能力，降低巨噬細(xì)胞向M1型方向極化，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M2型巨噬細(xì)胞方向極化并分泌成骨相關(guān)細(xì)胞因子。（g）支架的電活性和免疫調(diào)節(jié)能力協(xié)同促進(jìn)糖尿病牙周骨缺損再生。
一、PGO-PHA-AG支架具有良好的導(dǎo)電性能、力學(xué)性能、回復(fù)性、吸液能力
PDA功能化可加強(qiáng)PGO的導(dǎo)電性，PGO為支架提供了導(dǎo)電通路，使支架具有良好的導(dǎo)電性能。PHA和PGO納米顆粒的納米增強(qiáng)效應(yīng)增加了支架的壓縮強(qiáng)度。PGO的親水性為支架帶來優(yōu)異的吸液能力（圖2）。
圖2 PGO、PHA、PGO-PHA-AG支架的表征。（a）PGO的TEM圖像。（b）GO、rGO、PGO分散于去離子水中60分鐘后的圖像。（c）PHA的TEM和（d）高分辨TEM圖像。（e）PHA表現(xiàn)出典型的丁達(dá)爾效應(yīng)。（f, g）PGO-PHA-AG支架的SEM圖像。（h）PGO-PHA-AG支架的EDS元素mapping圖像。（i）PGO-PHA-AG支架接入電路并點(diǎn)亮發(fā)光二極管（LED）。（j）不同PGO含量的支架的電導(dǎo)率。（k）壓縮PGO-PHA-AG支架后的電導(dǎo)率（0, 25, 50, 75%）。（l）AG支架、PHA-AG支架、PGO-PHA-AG支架的壓縮強(qiáng)度。（m）對帶有發(fā)光二極管的PGO-PHA-AG支架進(jìn)行壓縮，壓縮應(yīng)力去除后回復(fù)到初始形狀。（n）將PGO-PHA-AG支架置于含羅丹明的去離子水中3秒。（o）AG、PHA-AG、PGO-PHA-AG支架的吸液能力。
二、PGO-PHA-AG支架具有良好的電活性、活性氧清除能力和免疫調(diào)節(jié)能力
PGO-PHA-AG電活性支架是一個(gè)有前景的促干細(xì)胞成骨分化平臺。PHA為支架提供骨誘導(dǎo)能力，PGO為支架提供導(dǎo)電通路。電刺激和PGO-PHA-AG支架協(xié)同促進(jìn)BMSCs的成骨分化。PGO-PHA-AG支架將電信號傳遞給BMSCs，激活BMSCs表面的Ca2+通道，細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度增加，進(jìn)而促進(jìn)BMSCs的成骨分化（圖3）。由于支架表面豐富的鄰苯二酚基團(tuán)和氧化還原性能，其可有效保護(hù)細(xì)胞免受過量ROS的損害（圖4）。PGO-PHA-AG支架可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞從M1型極化為M2型，并促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞分泌成骨相關(guān)細(xì)胞因子（圖5）。為探究支架對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)控機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)對不同組的巨噬細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序。結(jié)果發(fā)現(xiàn)支架一方面通過清除ROS抑制糖酵解通路減少M(fèi)1型巨噬細(xì)胞，另一方面通過RhoA/ROCK信號通路激活巨噬細(xì)胞向M2型極化（圖6）。
圖3 支架表面的BMSCs的粘附和高通量電刺激。（a）BMSCs在AG、PHA-AG和PGO-PHA-AG支架表面的細(xì)胞形態(tài)。（b）BMSCs的細(xì)胞鋪展面積。（c）培養(yǎng)3和7天后，BMSCs在不同支架上的增殖活性。（d）高通量電刺激的示意圖。電活性支架向BMSCs傳遞電信號，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流，最終促進(jìn)BMSCs成骨分化。（e）在不同電壓刺激下，14天后不同支架上的BMSCs堿性磷酸酶（ALP）活性。（f–h）培養(yǎng)14天后，有無電刺激對不同支架上的成骨相關(guān)基因表達(dá)的影響，包括I型膠原（COL1A1）、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（Osx）、堿性磷酸酶（ALP）。（i）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測異硫氰酸熒光素（FITC）通道中Fluo-4 探針標(biāo)記的細(xì)胞，檢測電刺激對PGO-PHA-AG支架上細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度的影響。
圖4 PGO-PHA-AG支架的體外抗氧化性能。（a）PGO-PHA-AG支架的抗氧化能力的機(jī)制。（b）PGO-PHA-AG支架的循環(huán)伏安（CV）曲線。（c）不同支架清除DPPH自由基的效率。（d）不同支架清除細(xì)胞內(nèi)ROS的性能。（e）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測FITC通道中DCFH-DA標(biāo)記的細(xì)胞。
圖5 PGO-PHA-AG支架對巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)能力。（a）和不同支架培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、CD163、細(xì)胞核的免疫熒光染色。（b）iNOS和CD163的免疫蛋白印跡分析。（c）通過流式細(xì)胞術(shù)檢測CD86（M1型巨噬細(xì)胞）和CD206（M2型巨噬細(xì)胞）的表達(dá)來評估巨噬細(xì)胞的極化情況。（d）M1巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，包括白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α （TNF-α）和iNOS。（e）M2巨噬細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)，包括CD206、CD163和精氨酸酶1（Arg1）。（f）巨噬細(xì)胞分泌的成骨相關(guān)基因，包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）和轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）。（g, h）巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)7天后BMSCs的ALP染色和ALP活性定量分析。（i）在巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)7天后，BMSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)，包括ALP、COL1A1和Runx2。（j, k）巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)14天后BMSCs的ARS染色和定量分析。
圖6 PGO-PHA-AG支架誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化的機(jī)制探究。（a）在AG和PGO-PHA-AG支架上培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞的基因本體分析。BP：生物過程；CC：細(xì)胞成分；MF：分子功能。（b）AG與PGO-PHA-AG組的KEGG通路富集分析。（c）對涉及HIF-1信號通路、糖酵解通路、促炎細(xì)胞因子、細(xì)胞粘附分子、細(xì)胞骨架排列和機(jī)械傳導(dǎo)的差異表達(dá)基因進(jìn)行熱圖分析。（d）PGO-PHA-AG支架上巨噬細(xì)胞極化機(jī)制示意圖。
三、PGO-PHA-AG在糖尿病牙周骨缺損模型中的促修復(fù)性能
基于支架良好的電活性、抗氧化活性、抗炎能力、免疫調(diào)節(jié)能力協(xié)同作用，該支架可加速糖尿病炎癥條件下的牙周骨組織修復(fù)再生（圖7和8），為設(shè)計(jì)免疫調(diào)節(jié)生物材料治療免疫相關(guān)疾病和組織再生提供了一種新的策略。
圖7 大鼠體內(nèi)糖尿病牙周骨缺損修復(fù)。（a）支架植入糖尿病大鼠牙周骨缺損模型。（b）大鼠下頜骨植入部位的Micro-CT圖像。（c）四組的骨密度（BMD）比較。（d）四組的骨體積與總體積的比率（BV/TV）比較。（e, f）植入后28天缺損區(qū)域的H&E和Masson染色。FT: 纖維組織；NB: 新骨；MB: 成熟骨。（g–l）植入后14天牙周缺損區(qū)域8-羥基脫氧鳥苷（8-OHdG）、4-羥基壬烯醛（4-HNE）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）（紅色）的免疫熒光染色和均一化熒光強(qiáng)度。
圖8 缺損區(qū)域的免疫熒光染色。（a–d）缺損區(qū)域iNOS和CD206（紅色）的免疫熒光染色，以及均一化熒光強(qiáng)度。（e–h）牙周缺損區(qū)域骨鈣素（OCN）和Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（Runx2）（綠色）的免疫熒光染色，以及均一化熒光強(qiáng)度。
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