藥品在生產(chǎn)合成和貯運過程中可能引入對人體有害的雜質(zhì)，其中一部分具有遺傳毒性風(fēng)險的稱為遺傳毒性雜質(zhì)。后者在很低濃度下即可誘導(dǎo)基因突變和染色體損傷，甚至導(dǎo)致癌癥并危及生命。
遺傳毒性雜質(zhì)本質(zhì)上是藥物生產(chǎn)或保存過程中難以避免，甚至不可避免的產(chǎn)物。制藥企業(yè)在藥物研發(fā)過程中，通常需花費大量時間和財力來驗證合成過程中不存在有遺傳毒性風(fēng)險的產(chǎn)物。遺傳毒性雜質(zhì)的出現(xiàn)也對監(jiān)管機構(gòu)提出了新的要求和挑戰(zhàn)。
然而，遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管起步較晚，自 2000年以后才陸續(xù)受到各國的重視。
近年來，歐盟、美國藥品監(jiān)管機構(gòu)相繼發(fā)布了遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)的指導(dǎo)原則。
如EMA人用藥委員會安全工作組（Committees for Human Medicinal Products， CHMP）于2004年發(fā)布《遺傳毒性雜質(zhì)限度指南》并首次提出毒理學(xué)相關(guān)閾值（Threshold of Toxicological Concern，TTC）限度的概念；
美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration， FDA）于2006年發(fā)布《原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)推薦方法》并提出使用決策樹 （Decision Tree）法對雜質(zhì)風(fēng)險進行評估；
人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會（International Council for Harmonization of Technical Requirement for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）在2017 年發(fā)布的ICH M7指導(dǎo)原則中為遺傳毒性雜質(zhì)的確認、研究和控制方法提供了指導(dǎo)性的建議和技術(shù)要求。
ICH M7的頒布具有里程碑式的意義，它將取代EMA遺傳毒性雜質(zhì)限度指南和美國FDA遺傳毒性雜質(zhì)指南草案，成為今后國際上廣泛通行的遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)性文件。
原國家食品藥品監(jiān)督管理局于2017年成為ICH正式成員，我國相關(guān)標準和指導(dǎo)原則已與國際接軌。
《中華人民共和國藥典》 （以下簡稱《中國藥典》）2015年版四部中已收載了《藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則》，國家藥典委員會于 2019年及時發(fā)布了《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》 （征求意見稿），當前，國家藥品監(jiān)督管理局正在推進ICH M7在我國的落地與轉(zhuǎn)化。
一系列指南性文件的出臺，彌補了我國與先進國家和組織之間的貿(mào)易與技術(shù)壁壘。
2 遺傳毒性雜質(zhì)控制策略
致癌性風(fēng)險在藥物研發(fā)階段即受到高度重視，通常會在研發(fā)早期開展基因突變遺傳毒性標準組合試驗對其致癌風(fēng)險進行評估，而有潛在風(fēng)險的化合物則及早停止研發(fā)。
雜質(zhì)因其特性有可能無法從藥物中去除，故根據(jù)人體暴露情況設(shè)置定量限成為可行的監(jiān)管方略。
EMA于2006年首先在遺傳毒性雜質(zhì)監(jiān)管中引入化學(xué)物質(zhì)慢性毒性研究的毒理學(xué)相關(guān)閾值概念，在700余種致癌物分析基礎(chǔ)上，提出以1.5μg·d-1為有潛在遺傳毒性風(fēng)險的化合物的TTC。該暴露水平下，人體終生服用該物質(zhì)的患癌可能性為十萬分之一。
美國藥品研究和制造商協(xié)會（The Pharmaceutical Research and Manufacturers of America，PhRMA）進一步對建立暴露時間與 TTC之間的關(guān)聯(lián)，建立“分期TTC”。
此外， PhRMA 率先提出了雜質(zhì)遺傳毒性五分類的概念，并以構(gòu)效關(guān)系（Structure-activity Relationship， SAR）為分類依據(jù)，根據(jù)警示結(jié)構(gòu)預(yù)測其誘導(dǎo)人體腫瘤的風(fēng)險。從而將化合物結(jié)構(gòu)作為堿基插入導(dǎo)致的突變和腫瘤形成的重要決策基礎(chǔ)，而評估堿基突變風(fēng)險的試驗方法也在分類中有重要權(quán)重。
“分期TTC”和五分類決策樹的概念對全球藥品雜質(zhì)監(jiān)管影響深遠，美國FDA的《遺傳毒性雜質(zhì)指南草案：原料藥和成品藥中遺傳毒性和致癌性雜質(zhì)》、 ICH M7及我國的《遺傳毒性雜質(zhì)控制指導(dǎo)原則》 相繼沿襲，是當前雜質(zhì)監(jiān)管領(lǐng)域的主要思路。
值得注意的是，“分期TCC”的具體限量在不同指南及法規(guī)中有所不同，如表1所示，我國則以ICH M7為制定監(jiān)管標準的重要依據(jù)。
本文以ICH M7為藍本就雜質(zhì)監(jiān)管要求作簡要介紹。
ICH M7主要適用于DNA 反應(yīng)活性雜質(zhì)，即在含量很低時便存在致堿基突變及誘發(fā)人體腫瘤的風(fēng)險。遺傳毒性雜質(zhì)毒性的確認及定量構(gòu)效關(guān)系（Quantitative Structure-activity Relationship， QSAR）數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建均以毒性研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)。
根據(jù)致突變和致癌風(fēng)險危害程度，ICH M7將所有雜質(zhì)歸為5類并提出相關(guān)控制策略。
1類雜質(zhì)：已知具有致突變性的致癌物。
對于該類雜質(zhì)，首先考慮去除雜質(zhì)，如果無法去除，則應(yīng)建立基于未觀察到作用水平（No Observed Effect Level， NOEL）致癌性數(shù)據(jù)的限度數(shù)值。
2類雜質(zhì)：致癌性未知的已知致突變物。
如存在閾值相關(guān)機制， 以每日允許暴露量（Permitted Daily Exposure， PDE）求限度值；如無閾值相關(guān)機制的證據(jù)，根據(jù)TTC確立限度。
3類雜質(zhì)：含警示結(jié)構(gòu)、與原料藥結(jié)構(gòu)無關(guān)且無致突變性數(shù)據(jù)的物質(zhì)。
根據(jù)TTC確定限度值，或根據(jù)致突變性試驗評價結(jié)果歸為2類 雜質(zhì)或5類雜質(zhì)并作相應(yīng)控制。
4類雜質(zhì)：含警示結(jié)構(gòu)、與原料藥或原料藥相關(guān)物質(zhì)的警示結(jié)構(gòu)相同，且經(jīng)測試認為無致突變性的物質(zhì)；按5類雜質(zhì) （普通雜質(zhì)）控制。
5類雜質(zhì)：無警示結(jié)構(gòu)，或有充分的數(shù)據(jù)證明警示結(jié)構(gòu)無致突變性或致癌性的物質(zhì)。
按普通雜質(zhì)控制。
判斷某個雜質(zhì)是否屬于遺傳毒性雜質(zhì)時，首先應(yīng)收集其相關(guān)細菌回復(fù)突變試驗、動物和人體致癌性數(shù)據(jù)。部分公開致癌性數(shù)據(jù)庫如表2所示。
2.1 已有致癌性或致突變性試驗數(shù)據(jù)的雜質(zhì)控制
雜質(zhì)具有已知致突變性或致癌性數(shù)據(jù)歸為1類致癌物，根據(jù)半數(shù)致癌劑量（MedianToxic Dose， TD50）線性外推法對其進行控制，即以誘導(dǎo)50%腫瘤發(fā)生率的劑量的五萬分之一為攝入量，可將腫瘤的發(fā)生風(fēng)險控制于十萬分之一。
致癌性強度數(shù)據(jù)庫 （Carcinogenicity Potency Database，CPDB）中已明確列出1547種致癌物的TD50值供公開查詢。在測定 TD50時，應(yīng)以單一動物種屬和單一性別特定器官的最低TD50為準。
無致癌性試驗數(shù)據(jù)的物質(zhì)，歸為第2類或第3類的雜質(zhì)，服用時間超過10年的藥物，單 一雜質(zhì)的攝入量為1.5 µg·d-1，可以應(yīng)用TTC作為大多數(shù)毒性化合物作為可接受攝入量的默認值。
如原料藥質(zhì)量標準中存在兩個2類或3類雜質(zhì)，應(yīng)制定各自限度值；如果含3種或更多的2類或3類雜質(zhì)，可按多個雜質(zhì)的總可被接受攝入量（服用時間超過10年的藥物雜質(zhì)5 µg·d-1）計算（如表2）。
值得注意的是，1類雜質(zhì)和制劑中形成的降解產(chǎn)物應(yīng)單獨控制，不計入2類和3類雜質(zhì)的總限度值。黃曲霉素類物質(zhì)、N-亞硝基化合物和偶氮類等強致突變性化合物屬于關(guān)注隊列（Cohort of Concern， COC），TTC法對該類化合物不適用，其TD50應(yīng)低于1.25 mg·（kg·d）-1。
某些DNA反應(yīng)性化合物可能受到某種代謝或調(diào)控通路影響，其實際閾值或攝入量與致癌性呈非線性關(guān)系，如乙基甲烷磺酸鹽、過氧化氫、苯胺類化合物等，可使用NOEL或 PDE[計算公式：（NOEL×體質(zhì)量）/（動物與人用劑量差異系數(shù)×不同人體之間差異×研究時間系數(shù) ×嚴重情況系數(shù)×觀察到反應(yīng)的最低劑量）]確定限量值（如表3所示）。
2.2 無已知致突變性及致癌性試驗數(shù)據(jù)的雜質(zhì)控制
絕大多數(shù)雜質(zhì)缺乏充分的遺傳毒性和致癌性研究數(shù)據(jù)，往往難以歸類。
遺傳毒性的“警示結(jié)構(gòu)”指雜質(zhì)中的某些特殊基團或亞單位可與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而導(dǎo)致基因突變或染色體重排/斷裂，具有潛在致癌風(fēng)險。而產(chǎn)生遺傳毒性致癌性的化合物，從作用機制上分析均具有DNA反應(yīng)活性，通過與遺傳物質(zhì)發(fā)生化學(xué)鍵合引起遺傳信息改變產(chǎn)生致癌性，而基因突變往往是遺傳毒性致癌性作用的起始環(huán)節(jié)。
Ashby和Benigni等根據(jù)高 DNA反應(yīng)活性可以認為是堿基突變及腫瘤形成最初階段的原理，歸納并提出了18種化學(xué)結(jié)構(gòu)的“警示結(jié)構(gòu)（Alert Structure）”模型，包括酰鹵、烷基或苯基磺酸酯、烷基或苯基磷酸酯、N-羥甲基衍生物、單鹵代烯烴、硫芥、氮芥等，如圖1所示。
隨后，在國際上提出采用 “警示結(jié)構(gòu)”作為區(qū)分普通雜質(zhì)和遺傳毒性雜質(zhì)的重要依據(jù)的概念。這一概念已廣泛應(yīng)用于遺傳毒性和致癌性預(yù)測軟件，也成為遺傳毒性警示結(jié)構(gòu)以及QSAR模型的基礎(chǔ)。
對于存在“警示結(jié)構(gòu)”的雜質(zhì)進行QSAR預(yù)測和體內(nèi)外相關(guān)研究，或?qū)⑵浜靠刂圃谝欢ǚ秶畠?nèi)。當前已有多種計算機軟件可對化合物的遺傳毒性進行預(yù)測，如基于文獻報道和專家知識的預(yù)測軟件Toxtree（Joint Research Centre of European Chemical Bureau）、Derek Nexus（Lhasa Limited）和基于統(tǒng)計學(xué)的預(yù)測軟件如Sarah Nexus（Lhasa Limited）和 CASE Ultra（MultiCase Inc.）等。
這些預(yù)測決策樹或根據(jù)既往Ames試驗或微核試驗等遺傳毒性試驗數(shù)據(jù)，或根據(jù)警示結(jié)構(gòu)的遺傳毒性陽性可能性來生成判斷結(jié)果。
然而，現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫在預(yù)測效力上存在一定局限性。新藥研發(fā)催生大量新型有效藥物成分（Act ive Pharmaceutical Ingredient，API）和新型合成路線的誕生，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫信息與浩如煙海的雜質(zhì)種類相比乃九牛之一毛。
一項針對十余家跨國藥企百余種合成路線產(chǎn)生的雜質(zhì)的研究中共發(fā)現(xiàn)600多種警示結(jié)構(gòu)，其中烷化劑、芳香胺、酰胺類及芳香硝基衍生物類警示結(jié)構(gòu)占總警示結(jié)構(gòu)的61.3%。
值得關(guān)注的是含酰氯衍生物、烷基醛及硼酸類警示 結(jié)構(gòu)的化合物在該研究中占總警示結(jié)構(gòu)的5.8%、 4.7%和3.5%，但在已知致癌信息數(shù)據(jù)庫中僅占 0.5%、0%和0%。故上述警示結(jié)構(gòu)的化合物的致癌性有必要進行試驗研究。
此外，含有“警示結(jié)構(gòu)” 的化合物并非一定具有遺傳毒性。以常用解熱鎮(zhèn)痛藥對乙酰氨基酚（4-Acetamidophenol/N-acetylp-aminophenol，APAP）為例，2011年國家藥品抽檢的APAP藥品中含有多種苯酚類雜質(zhì)，基于決策樹的毒性預(yù)測平臺Toxtree預(yù)測其中絕大多數(shù)含有遺傳毒性致癌性警示結(jié)構(gòu)、多數(shù)含Ames致突變性試驗陽性警示結(jié)構(gòu)和體內(nèi)微核試驗陽性警示結(jié)構(gòu)， 如表4所示。
然而，實際臨床及動物長期研究數(shù)據(jù)并不提示APAP存在致癌性。再以ICH M7推薦使用 的毒理學(xué)數(shù)據(jù)庫Derek Nexus為例，其對截至2005年已有206種化合物的預(yù)測結(jié)果的一致性為86%，靈敏性為73%；而對2005-2011年間新增的化合物的預(yù)測度的一致性為89%，靈敏度降低至50%。
比如，Derek Nexus對4-氯乙?；阴１桨返闹峦?變性預(yù)測結(jié)果為陰性，然而在多個實驗室共同開展 Ames試驗聯(lián)合驗證工作中均得到明確陽性結(jié)果。
預(yù)測靈敏度的降低提示存在致突變風(fēng)險的化合物無法通過軟件預(yù)測的方法獲知，監(jiān)管工作中僅憑借構(gòu)效分析軟件預(yù)測結(jié)果仍然存在風(fēng)險。此外，某些創(chuàng)新藥的化學(xué)結(jié)構(gòu)可能難以通過數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測。
無論基于經(jīng)驗或統(tǒng)計學(xué)的數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建，其預(yù)測結(jié)果的準確度都極大程度上依賴于真實的試驗數(shù)據(jù)?？梢婇_展試驗研究對雜質(zhì)毒性評價具有重要價值。
3 藥物雜質(zhì)致突變性評價方法
由遺傳毒性發(fā)生的機理可知，基因突變是腫瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)。
以堿基突變?yōu)樵u價終點的Ames 試驗和體內(nèi)Pig-a基因突變試驗，均作為雜質(zhì)遺傳毒性風(fēng)險評價的首選試驗方法，其試驗數(shù)據(jù)已獲得FDA認可。評價受試物與DNA作用風(fēng)險的彗星試驗結(jié)果對雜質(zhì)遺傳毒性評價也有一定參考。
雜質(zhì)毒性評價的另一大難題，是可合成或獲取的雜質(zhì)量難以滿足試驗需要，而ICH M7要求盡量使用雜質(zhì)純品開展評價；此外，單一化合物可能有10～20余種雜質(zhì)。
受試物需求量少、試驗周期短的快速評價方法才能滿足大量雜質(zhì)遺傳毒性評價的迫切需求，故有必要優(yōu)化和改進傳統(tǒng)遺傳毒性評價方法。
3.1 Ames試驗
細菌回復(fù)突變試驗（ B a c t e r i a l R e v e r s e Mutation Test，Ames），1970年由Bruce. N. Ames 使用組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌株 （S.Typhimurium）建立，故命名為Ames試驗。
該試驗利用缺乏合成組氨酸能力的細菌在可誘導(dǎo)堿基突變的化合物的作用下可通過發(fā)生回復(fù)突變，從而自行合成組氨酸來形成大量肉眼可見的菌落的原理，通過菌落計數(shù)來評價受試物的堿基突變能力。
該方法是當前所有遺傳毒性評價方法中對致癌物預(yù)測度最高的試驗，Ames試驗對大鼠致癌物和恒河猴致癌物的檢出率分別為69.0%和87.5%，也是化合物QSAR構(gòu)效關(guān)系建立的遺傳毒性篩選數(shù)據(jù)庫的重要基礎(chǔ)。
隨著分子生物技術(shù)發(fā)展的飛躍，Ames作為一項經(jīng)典的致突變性篩選方法經(jīng)歷了一系列改良， 比如微孔板、液態(tài)培養(yǎng)法或引入含熒光報告基因等。
ICH M7認可基于標準平皿的Ames試驗數(shù)據(jù)。
但某些雜質(zhì)合成困難，基于微孔板的Ames 試驗，如Mini-Ames（6孔板）或Micro-Ames（24孔 板）在不改動傳統(tǒng)Ames 試驗原理的條件下可減少雜質(zhì)的用量，極具應(yīng)用潛力。
OECD正在對Ames試驗指導(dǎo)原則進行修訂，并于2018年在國際范圍內(nèi)收集Mini-Ames、Micro-Ames和Ames波動試驗的背景數(shù)據(jù)，試圖形成標準化的操作流程。然而非標準平皿的Ames試驗各家實驗室操作流程差異很大，較難形成統(tǒng)一操作標準，可能對審評工作造成一定難度。
開展相關(guān)試驗方法與傳統(tǒng)試驗方法結(jié)果的一致性比較則有助于數(shù)據(jù)互認和評價效率。
筆者完成的 Ames與Mini-Ames 試驗中陰性與陽性對照組回復(fù)突變菌落數(shù)比較如表5所示。
3.2 Pig-a 基因突變試驗
體內(nèi)Pig-a基因突變試驗是近年來在藥物安全性評價領(lǐng)域日益受到重視的一項藥物致突變性評價方法。
Pig-a基因位于X染色體，該基因突變可導(dǎo)致糖化磷脂酰肌醇（Glycosylphos-phatidyl Inositol，GPI）合成障礙，從而使相關(guān)細胞GPI錨蛋白（如CD48、CD55、CD59等）缺失。
因GPI錨蛋白在不同物種間的生物合成高度保守，且在各類組織細胞及各類成熟紅細胞中均有表達，故試驗可使用正常動物外周血作為試驗系統(tǒng)。
Araten等在1999年首次提出Pig-a基因突變試驗可用于藥物基因突變風(fēng)險評價。
Dertinger等進一步將高通量免疫磁性篩選技術(shù)引入Pig-a基因突變試驗，有效提高了統(tǒng)計功效。
該方法當前已完成多中心聯(lián)合驗證，OECD擬于2020年正式發(fā)布相關(guān)指導(dǎo)原則。
當Ames試驗結(jié)果不明確時，體內(nèi)Pig-a基因突變試驗可作為后續(xù)選擇的試驗方法，其結(jié)果已獲得美國FDA認可。
體內(nèi)Pig-a基因突變試驗的主要優(yōu)勢在于可檢測弱致突變劑體內(nèi)蓄積后的致突變風(fēng)險，并獲得受試物對嚙齒類動物致癌風(fēng)險的相關(guān)數(shù)據(jù)。
但其缺點也較為突出，即受試物需求量較大，試驗周期長，對于合成量較少的雜質(zhì)來說存在一定困難，且不適合大量雜質(zhì)毒性篩選。
但體內(nèi)Pig-a 基因突變試驗尚未經(jīng)過國內(nèi)聯(lián)合驗證及推廣，實際上具有相關(guān)試驗?zāi)芰徒?jīng)驗的國內(nèi)安全性評價中心很少。
近年來，國內(nèi)外陸續(xù)開展基于TK6、MCL-5以及L5178Y等哺乳動物細胞系的體外Pig-a基因突變試驗建立與驗證工作。
體外Pig-a基因突變試驗的優(yōu)點是使用的受試物用量少、試驗周期短（一 般受試物處理8天后檢測）、不使用動物和適于進行機制研究。
但是，在安全評價領(lǐng)域正式使用之前，在細胞選擇和標準化試驗方法的驗證等方面還需要開展大量工作。
體內(nèi)及體外Pig-a基因突變試驗優(yōu)劣對比詳見表6。
3.3 彗星試驗
Ostling和Johansson于1984年建立彗星實驗 （Comet Assay），也稱為單細胞凝膠電泳（Single Cell Gel Electrophoresis，SCGE），可在單細胞水平上檢測DNA鏈斷裂程度，從而評價受試物是否與 DNA相互作用。
該方法利用損傷的DNA與完整的 DNA在電泳中遷移速率差異，對存在DNA損傷的細胞（形成彗星樣結(jié)構(gòu)）進行區(qū)分。
因DNA斷裂多在給藥后短期內(nèi)出現(xiàn)，該方法可靈敏地檢出短時間內(nèi)出現(xiàn)的DNA損傷。
但DNA單鏈斷裂可自行修復(fù)，損傷不一定遺傳給子代細胞。故彗星試驗的結(jié)果可作為參考，用于判斷受試物與DNA堿基作用的可能性，其結(jié)果對雜質(zhì)的遺傳毒性有一定預(yù)測作用。
國際肝細胞彗星試驗實驗室間聯(lián)合驗證于2015年完成并發(fā)表，OECD于2014年頒布體內(nèi)彗星試驗指導(dǎo)原則。
4 小結(jié)
綜上所述，隨著大量創(chuàng)新藥及仿制藥的出現(xiàn)，迫切需要加強遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管。
我國已陸續(xù)出臺了一系列與國際接軌的指南性文件以支持雜質(zhì)的毒性評估，但實際工作中難點尚存。
如傳統(tǒng)方法在雜質(zhì)評價中存在局限性，指南性文件對雜質(zhì)的遺傳毒性評價要求不明確，缺乏新方法與傳統(tǒng)方法之間的一致性比較，藥物合成路線實際產(chǎn)生的大量含警示結(jié)構(gòu)雜質(zhì)無毒理學(xué)研究數(shù)據(jù)支持，基于構(gòu)效分析的毒性預(yù)測軟件的預(yù)測效力不足等。
此外，通過對國家藥品抽檢數(shù)據(jù)庫與歐洲藥典分析比對，我國國抽藥品實際檢出雜質(zhì)與歐洲藥典中所列出的雜質(zhì)類型存在較大差異，其原因可能與藥物合成加工方式不同有關(guān)。
我國藥典中對藥品可能存在的雜質(zhì)和具體定量限要求缺乏詳細明確的界定，而歐洲藥典中的雜質(zhì)毒性及定量限的信息又難以借鑒。
上述因素對監(jiān)管人員在藥物化學(xué)、遺傳毒性評價等多領(lǐng)域的知識儲備提出了新的挑戰(zhàn)。遺傳毒性雜質(zhì)的監(jiān)管不是紙上談兵，應(yīng)充分結(jié)合計算機毒理學(xué)、毒性評價方法和制定符合我國國情的監(jiān)管限度值，從三個維度切實做好雜質(zhì)的控制，從而提高藥物的安全性，保障人民用藥安全。
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