藥品的質(zhì)量可控性通過研發(fā)中的質(zhì)量研究與生產(chǎn)中的質(zhì)量控制的方式實(shí)現(xiàn)，在藥品質(zhì)量控制過程中有很多檢測項(xiàng)目，每個檢測項(xiàng)目會對應(yīng)一個分析方法，每個分析方法需要有一定的理論基礎(chǔ)和保證提供的檢測數(shù)據(jù)真實(shí)、準(zhǔn)確和靈敏，因此，針對新開發(fā)的分析方法，變更的分析方法等均需要進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證以保證分析方法在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。分析研發(fā)人員在分析方法驗(yàn)證之前往往會對一些項(xiàng)目進(jìn)行預(yù)驗(yàn)證，也可以理解為在方法開發(fā)過程中初步的判斷方法的適用性，那么如何選擇方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證中的項(xiàng)目呢，本文結(jié)合具體實(shí)例對方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證中的關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行了幾點(diǎn)思考，希望與廣大同行共同探討研究。
實(shí)例一：在某有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證中，雜質(zhì)A的LOQ濃度點(diǎn)的回收率總是偏高，已知該分析方法為等度洗脫。
原因調(diào)查：在改變有機(jī)相比例過程中，發(fā)現(xiàn)加標(biāo)的系統(tǒng)適用性溶液在雜質(zhì)A相鄰位置多一個未知雜質(zhì)的色譜峰，并且在忽略限以下，因?yàn)樵治龇椒ㄖ须s質(zhì)A與該未知雜質(zhì)未實(shí)現(xiàn)基線分離導(dǎo)致LOQ濃度點(diǎn)雜質(zhì)A的回收率總是偏高；
方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)一：耐用性的考察。在方法開發(fā)之初，以API為例，通過對粗品、強(qiáng)制降解試驗(yàn)樣品和加標(biāo)系統(tǒng)適用性樣品的分離度考察方法的專屬性，擬定分析方法之后通過耐用性的預(yù)驗(yàn)證（改變柱溫、流速、有機(jī)相比例、鹽濃度等）或許可以優(yōu)化出更佳的分析方法，特別是在更換色譜柱的考察中可以確定方法是否對色譜柱的選擇性較高，尤其是應(yīng)用非新色譜柱開發(fā)方法時，在更換新批號同款色譜柱時方法無法重現(xiàn)，出現(xiàn)峰形變差，分離度變低等情況，需要考慮優(yōu)化開發(fā)的方法，或者考慮如何處理新買色譜柱后用于本方法的使用（如方法中采用離子對試劑為流動相，需要長時間的平衡色譜柱，否則可能出現(xiàn)方法無法重現(xiàn)的情況發(fā)生，那么在方法轉(zhuǎn)移中就會出現(xiàn)比較大的麻煩。或者個別的方法需要在新購置的色譜柱中重復(fù)進(jìn)樣供試品濃度一定的針數(shù)后，才能滿足系統(tǒng)適用性的要求等）。
實(shí)例二：在某API有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證中，專屬性驗(yàn)證中，擬進(jìn)樣順序酸堿破壞空白-酸堿破壞樣品-氧化破壞空白-氧化破壞樣品……，在破壞樣品進(jìn)樣后，空白樣品中在主峰位置出現(xiàn)較大的殘留，如圖1和圖2所示。
原因調(diào)查：排除進(jìn)樣瓶、容量瓶等溶液制備中產(chǎn)生的殘留，殘留來自進(jìn)樣針，更改洗針液和延長洗針時間后，殘留問題解決。
方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)二：考察待測組分的溶解度，優(yōu)選合適的洗針液，并且考察不同的洗針次數(shù)和時間；
實(shí)例三：在某API有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法的方法學(xué)驗(yàn)證中，各雜質(zhì)峰形均良好，但是其中一個異構(gòu)體的雜質(zhì)B峰形對稱性一般，如圖3中所示。
方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)三：線性與回收率的考察。因?yàn)殡s質(zhì)B的色譜峰對稱性一般在預(yù)驗(yàn)證中考察線性是否能通過，并且通過加標(biāo)試驗(yàn)考察回收率，確定雜質(zhì)B的回收率是否能滿足方法學(xué)驗(yàn)證的要求。
實(shí)例四：在某API含量的方法學(xué)驗(yàn)證中，發(fā)現(xiàn)對照品溶液隨著時間的延長峰面積逐漸的減小，經(jīng)過計(jì)算分析，在進(jìn)樣6h峰面積RSD為3.2%，進(jìn)樣4h峰面積RSD為1.8%，擬定溶液穩(wěn)定性的可接受標(biāo)準(zhǔn)為各時間點(diǎn)峰面積的RSD≤2%；
方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)四：對照品溶液穩(wěn)定性考察，包括對照品貯備液、對照品溶液分別在進(jìn)樣室內(nèi)和冰箱內(nèi)的穩(wěn)定性，以便確定溶液是否臨用新制，是否需要控制進(jìn)樣室的溫度。當(dāng)然，同時考察供試品溶液的穩(wěn)定性，考察溶液是否需要臨用新制。穩(wěn)定性考察的時間長度可以根據(jù)實(shí)際情況制定，如每針的洗脫時間，對照品是否容易購買等。如果對照品剩余數(shù)量不多，可以計(jì)算方法學(xué)各驗(yàn)證項(xiàng)完成后需要的時間，盡可能的把溶液穩(wěn)定性的考察時間延長。另外，如果供試品及對照品的制備中應(yīng)用的純有機(jī)試劑為溶劑，更應(yīng)該對溶液穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)驗(yàn)證，根據(jù)考察結(jié)果確定二級溶劑是否需要用流動相，或者是否需要控溫的進(jìn)樣室。
實(shí)例五：某API的殘留溶劑GC分析方法學(xué)驗(yàn)證中，采用外標(biāo)一點(diǎn)法進(jìn)行定量計(jì)算，回收率不符合要求；
原因調(diào)查：API的基質(zhì)效應(yīng)比較大，通過標(biāo)準(zhǔn)加入法重新考察方法的回收率后，結(jié)果符合方法學(xué)驗(yàn)證的要求；
方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)五：定量方法的準(zhǔn)確性，對于受基質(zhì)效應(yīng)影響較大的方法需要對定量方法的選擇進(jìn)行優(yōu)選。如果采用加校正因子的主成分自身對照法進(jìn)行雜質(zhì)定量時，需要對校正因子的影響因素進(jìn)行考察，避免發(fā)生定量偏低，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確的情況發(fā)生。
實(shí)例六：某有關(guān)物質(zhì)的HPLC分析方法在轉(zhuǎn)移時，接收方總是出現(xiàn)鬼峰。
原因調(diào)查：樣品在進(jìn)樣之前經(jīng)過濾膜過濾，轉(zhuǎn)移方一般會用10ml左右的溶劑潤洗濾膜，而接收方只是用溶劑過濾三滴左右，結(jié)果接收方的色譜圖中總是出現(xiàn)一個未知的峰，并且在LOQ以上，導(dǎo)致分析方法轉(zhuǎn)移失敗。
方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證關(guān)鍵點(diǎn)六：溶液配制用滴管，濾膜等干擾排查，一些一次性塑料滴管，濾膜等經(jīng)常會有不明有機(jī)物遷移到樣品中，在進(jìn)樣分析中會對檢測結(jié)果造成干擾，因此，需要考察滴管是否需要應(yīng)用玻璃滴管，濾膜需要預(yù)先用多少溶劑潤洗，進(jìn)樣小瓶是否需要樣品潤洗及潤洗次數(shù)。
綜上，方法學(xué)預(yù)驗(yàn)證不需要將全部的方法學(xué)驗(yàn)證內(nèi)容進(jìn)行全盤預(yù)演，而是針對方法的特異性進(jìn)行專屬的預(yù)驗(yàn)證選擇，當(dāng)然也是優(yōu)化方法或者進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證前的SOP確認(rèn)的過程，經(jīng)過這樣的操作，最終也是為了保證方法學(xué)驗(yàn)證各項(xiàng)的順利通過與轉(zhuǎn)移，并且方法應(yīng)用在有關(guān)物質(zhì)檢查等項(xiàng)目中可以給出專屬、準(zhǔn)確、靈敏的檢測結(jié)果。
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