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過去十年生物制品行業(yè)蓬勃發(fā)展，生物制品的各類很多，一些常見的疫苗、血液制品、抗體藥物、重組蛋白等等，還有PD-1、PD-L1為代表的免疫檢查抑制劑和以CAR-T為代表的細胞治療已經(jīng)成為非常火熱的研究領(lǐng)域，隨著新冠疫情的爆發(fā)，也催生了一大波疫苗的研發(fā)浪潮。

生物制品大都是從天然來源的（人體、或動物）中分離出來的，通過生物技術(shù)方法和其它尖端技術(shù)生產(chǎn)的藥品。生物制品的成分可以是糖、蛋白質(zhì)或核酸類物質(zhì)的復雜組合，也可以是細胞或組織的活體。

01法規(guī)強檢要求

生物制品在上市前必須要進行安全性檢查的，其中細菌內(nèi)毒素和熱原作為非常關(guān)鍵的檢測項目。藥品中不得有熱原污染的，否則在臨床應用上會產(chǎn)生嚴重的不良反應。

那這些熱原物質(zhì)是這樣作用于我們的人體免疫系統(tǒng)的，首先藥物中的熱原進入人體內(nèi)通過Toll樣受體（Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。）通過受體來刺激單核細胞，隨后活化后的單核細胞釋放促炎細胞因子，啟動發(fā)熱反應。

02細菌內(nèi)毒素檢測方法介紹

家免熱原檢測法是通過向家兔的耳緣靜脈注射藥物，觀察給藥后體溫的升高情況，來判定藥品是否含有熱原。單核細胞活化試驗是通過測定人血單核細胞的細胞因子的釋放來定量產(chǎn)品中的執(zhí)原物質(zhì)。

內(nèi)毒素檢測法：第一種就是大家所熟知的鱟試劑檢測，作為一種藥典方法是現(xiàn)在各大企業(yè)最常用的方法，包括凝膠法和動態(tài)濁度法。通過內(nèi)毒素和鱟試劑發(fā)生酶聯(lián)級反就，最終來定量內(nèi)毒素的。由于鱟資源的短缺，國家一直都在尋找一種替代鱟試劑的方法。

重組因子C檢測法：第二種是重組因子C檢測法，就是大家正在尋找的鱟試劑檢測法的替代方法，它的反應原理就是通過一個重組的C因子來和內(nèi)毒素進行結(jié)合，最終通過熒光信號來定量產(chǎn)品中的內(nèi)毒素。

這兩種方法僅可以鑒別革蘭氏陰性菌中的細菌內(nèi)毒素。無法檢測出非內(nèi)毒素的熱原。其次是無法完全呈現(xiàn)人體的免疫反應。

通常來說終產(chǎn)品中的熱原和細菌內(nèi)毒素都是生產(chǎn)各個部分的集合，因為生物制品不耐熱，不采用終端滅菌，所以為了減少成品中內(nèi)毒素的污染我們需要將內(nèi)毒素的檢測與控制慣穿于生不的每一介環(huán)節(jié)。

首先生物制品生產(chǎn)過程中的原材料會有外源因子引入的風險，因此需要對生產(chǎn)中使用的原材料進行嚴格的質(zhì)量控制，原材料、原液配方、瓶裝產(chǎn)品中，細菌內(nèi)毒素就是一個關(guān)鍵的檢測項目。

工藝用水在整個生產(chǎn)過程中也是一個非常重要的生產(chǎn)原料，在GMP體系下QC是要對水系統(tǒng)進行日常的監(jiān)測的。

03細菌內(nèi)毒素的工藝過程控制

因生物制品和傳統(tǒng)藥物有很大不同，生產(chǎn)過程中對微生物的控制策略也不同。

首先生物制品的成分都是比較復雜的，幾乎所有的生物制品都是復雜的混合物，不容易進行鑒定或者表征。

其次在整個生物制品的生產(chǎn)過程中非常容易受到微生物地的污染，而這些產(chǎn)品往往又是不耐熱的，無法通過終端滅菌來實現(xiàn)無菌控制的，所以我們往往需要從最初的生產(chǎn)步驟就開始對微生物進行控制。

以抗體藥物的原液生產(chǎn)為例，它的生產(chǎn)工藝主要包括上游生產(chǎn)和下游生產(chǎn)，各大公司在生產(chǎn)操作中都會采取特定的微生物控制策略。在商業(yè)化生產(chǎn)階段需要對每批配制好的培養(yǎng)基進行微生物限度和內(nèi)毒素的取樣檢測。

在整個細胞培養(yǎng)的過程中與產(chǎn)品直接接觸的設(shè)備耗材都是經(jīng)過滅菌或直接使用一次性耗材。

這個過程其實是處于一個無菌的狀態(tài)，也是非?？煽氐模@個過程其實是不需要進行內(nèi)毒素檢測的。在細胞收獲階段，由于這個過程不是無菌操作，所以可以對細胞收獲液進行取樣檢測微生物限度和內(nèi)毒素。這兩個結(jié)果可以反映出在整個收獲階段微生物控制狀況是如何的。

常規(guī)的下游生產(chǎn)工藝包括洗脫、層析步驟、病毒滅活、過濾、超濾、分裝等。像先脫、層析后可以對細菌內(nèi)毒素和微生物負荷進行檢測。是可以反映這個生產(chǎn)工藝中微生物控制的狀況是怎樣的。

由于細菌內(nèi)毒素很容易吸附在生產(chǎn)用具上，所以對生產(chǎn)用具和管道、取樣器具等，使用前應進行除熱原處理，耐熱的玻璃和不銹鋼器具可采用180℃4h或250℃30min干熱滅菌，不耐高溫的如硅膠管、膠塞等清潔完成后進行濕熱滅菌。對培養(yǎng)罐、閥門、層析柱等進行在位滅菌。

工藝去除手段，內(nèi)毒素的脂肪A部分具有疏水性，在高鹽下會凝集，而目標蛋白質(zhì)可吸附在疏水介質(zhì)上，因此可以利用疏水層析去除內(nèi)毒素。

如果原液及保護劑的分子量和內(nèi)毒素的分子量差別很大，可通過超濾法來去除內(nèi)毒素，但如果分子量與目標蛋白差別不大，超濾效果不好。

輔料方面，有些輔料可以進行干熱滅菌的，可考慮進行干熱滅菌，如NaCl、KBr、（NH4）2SO4等均可干熱滅菌。

人員的無菌操作也是關(guān)鍵因素，操作者必須按照SOP進行更衣、洗手、消毒。在離心、層析進出樣及超濾操作時應注意對容器口的保護，每一步純化收集的樣品應在最短時間內(nèi)冷藏，不可放置在室溫環(huán)境內(nèi)過久。

對于生物制品生產(chǎn)中防止內(nèi)毒素污染的控制最主要的方式是生產(chǎn)過程控制，即嚴格執(zhí)行操作要求，嚴格遵守無菌操作，防止內(nèi)毒素的產(chǎn)生。