摘要
作為藥物分析人員，在液相分析方法開發(fā)階段可能遇到過這樣的化合物：化合物峰型展寬嚴重，甚至出現(xiàn)譜峰裂分情況。使出洪荒之力，悻悻然發(fā)現(xiàn)，該異?，F(xiàn)象非溶劑強度過高所致，非主成分基質(zhì)效應所致，非流動相pH不適所致，亦非高能σ鍵旋轉(zhuǎn)瞬時形成多重構(gòu)象所致。盯著化合物看半天，某個瞬間，目光中露出了然的神色，原來是這個家伙—酮式-烯醇互變化合物。
酮式-烯醇互變化合物一般存在如下結(jié)構(gòu)：羰基的鄰位碳上即α碳上連接著具有酸性的α-質(zhì)子?；プ儺悩?gòu)體是容易相互轉(zhuǎn)化的結(jié)構(gòu)異構(gòu)體。
酮式-烯醇互變化合物一般具有以下特性：
1）在酸性條件下，酮式結(jié)構(gòu)會向烯醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。其內(nèi)在原理是：首先，羰基氧被酸質(zhì)子化以形成氧正離子化合物，隨后由酸引入的堿基會去除α-氫，這導致質(zhì)子化羰基的π電子移動到氧上，形成烯醇產(chǎn)物的羥基，同時再生成外加的酸催化劑。
2）在堿性條件下，酮式結(jié)構(gòu)同樣會向烯醇結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化。其內(nèi)在原理是：首先游離的堿基會進攻具有酸性的α-質(zhì)子，這導致羰基的π電子移動到α-碳上形成氧負離子化合物，隨后結(jié)合質(zhì)子，形成烯醇產(chǎn)物的羥基，同時再生成外加的堿催化劑。
3）在多數(shù)情況下，酮式結(jié)構(gòu)比烯醇式結(jié)構(gòu)具有更強的偶極距，故此，強偶極溶劑（也可叫做極性非質(zhì)子溶劑，常用的有DMSO、DMF）有利于酮式結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定，有助于烯醇結(jié)構(gòu)向具有高偶極矩的酮式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[1-3]?？紤]到液相色譜中DMSO及DMF的強末端吸收以及二者較強的溶解粘度，一般較少應用于液相色譜當中。
4) 烯醇式結(jié)構(gòu)由于存在羥基，故此，含有氫鍵受體的溶劑（一般含有孤對電子的原子如氧、氮均為較強的氫鍵受體）有利于烯醇式結(jié)構(gòu)體的穩(wěn)定，有助于酮式結(jié)構(gòu)向烯醇結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化[4, 5]。
5）隨著溫度的升高, 烯醇形成分子內(nèi)氫鍵以及分子間的氫鍵作用力減弱，烯醇含量降低 [6]。
基于上述理論知識，分享如下案例。實際工作過程中遇到一個醛類化合物，嘗試如下色譜條件下進行分析方法開發(fā)。以甲醇-水（30:70）為溶劑；用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（YMC-Triart C18 3.0μm，150mm×4.6mm）；以甲酸-水（1:1000）為流動相A，甲醇為流動相B，按下表進行線性梯度洗脫。流速為每分鐘1.0ml；檢測波長為210nm；柱溫箱溫度為45ºC；進樣體積為10μl。
線性洗脫梯度程序
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時間（分鐘） |
流動相A（%） |
流動相B（%） |
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0 |
70 |
30 |
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2 |
70 |
30 |
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5 |
45 |
55 |
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15 |
45 |
55 |
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23 |
25 |
75 |
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23.1 |
70 |
30 |
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28 |
70 |
30 |
目標化合物出峰情況如下所示。在不存在溶劑干擾的情況下，目標化合物，除了出一個明顯的尖峰外，緊接著會出現(xiàn)一個展寬嚴重的色譜峰。將該溶液進行LC-MS鑒定，結(jié)果顯示尖峰與展寬色譜峰對應的化合物具有相同的分子量。結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)，推斷二者互為酮式-烯醇式互變異構(gòu)體，且尖峰為烯醇式化合物（具有更強的極性），展寬嚴重的色譜峰為酮式化合物。
圖1空白溶劑及目標化合物色譜圖
為解決這一問題，筆者嘗試了兩種解決方案，均得到了較為滿意的結(jié)果。
解決方案1：為力求化合物以烯醇式單峰的形式出現(xiàn)，根據(jù)上文所述的酮式-烯醇互變化合物特性，將溶劑變更為等溶劑強度的乙腈-水-甲酸（50:50:0.1），將流動相B變更為乙腈-甲醇-甲酸（50:50:0.1），同時將柱溫箱溫度變更為20 ºC。減小流動相中甲醇的比例（由于存在其他雜質(zhì)選擇性的問題不能將流動相中甲醇全部替換成乙腈）以及將溶劑同步變更為乙腈的原因是乙腈為氫鍵受體，有利于與烯醇式結(jié)構(gòu)中的羥基形成氫鍵作用從而增加烯醇式結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；在溶劑以及流動相B中加入甲酸的原因是酸性體系下有利于酮式結(jié)構(gòu)會向烯醇式結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化；降低柱溫箱溫度的原因是較低低溫有利于烯醇形成分子內(nèi)氫鍵以及分子間的氫鍵作用力形成，從而增加烯醇式結(jié)構(gòu)體的穩(wěn)定性。變更流動相體系后，色譜圖中獲得了單一的尖銳色譜峰，從而問題得以解決。
圖2變更色譜條件后目標化合物色譜圖
解決方案2：我們知道含肼結(jié)構(gòu)的化合物在酸性條件下可以同醛酮類化合物反應。其反應原理如下所示：
為了規(guī)避酮式-烯醇互變異構(gòu)出現(xiàn)多重峰或異常峰的可能，筆者精密稱定5mg的酮式-烯醇互變化合物，用高濃度（一般為試樣濃度的100倍以上）的肼類化合物的弱酸性水溶液（可在肼類化合物水溶液中加入適量的磷酸）稀釋制成每1ml約含50μg的溶液，于60 ºC下（一般選擇50~80 ºC水?。┭苌?0min。由于水合肼或硫酸肼無紫外吸收，且不會引入異源雜質(zhì)干擾，故選擇其為衍生化試劑。實驗結(jié)果如下所示：
圖4化合物與肼衍生產(chǎn)物結(jié)構(gòu)示意圖
由上，采用與上述相同的色譜條件2進行實驗，僅在~5.1min出現(xiàn)一個相對于酮式和烯醇式極性更強的尖銳的色譜峰，而未出現(xiàn)~8.5min的烯醇結(jié)構(gòu)化合物的色譜峰。故此推測，在該衍生條件下烯醇式化合物會全部轉(zhuǎn)化為酮式結(jié)構(gòu)化合物并與肼進行衍生，生成在酸性流動相體系中極性更強的堿性腙類化合物，其結(jié)構(gòu)如圖4所示。
以上僅為筆者的個人見解，不當或錯誤之處敬請同行指正。對于酮式-烯醇互變化合物存在多重峰的異常情況若有更好的解決方式也請同行不吝賜教。
參考文獻
[1] Garland, E. W.; Nibler, J. W.;Shoemaker, D. P. Experimentsin Physical Chemistry, 7th ed. (and earliereditions); McGraw-Hill: New York, 2003; pp 453–461.
[2] Drexler, E.J.; Field, K. W. J. Chem. Educ. 1976, 53, 392–393.
[3] Spyridis, G.T.; Meany, J. E. J. Chem. Educ. 1988, 65, 461–462.
[4] Reichardt, C. Solvents andSolvent Effects in Organic Chemistry, 2nd ed; VCR: New York, 1988; p 2.
[5] Buemi, G.;Gandolfo, C. J. J. Chem. Soc., Faraday Trans. 2 1989, 85, 215–227
[6] 楊曉亮，等，有機化學研究簡報，2005年第25卷，1279~1282
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