層層自組裝技術(shù)(Layer-by-layer self-assembly, LBL)是最近二十年出現(xiàn)的一種借助分子之間的弱相互作用(例如靜電作用、氫鍵、配位鍵等)形成自組裝多層膜體系的技術(shù)。層層自組裝技術(shù)操作簡單、對制備環(huán)境及設(shè)備要求不高，自組裝基材的選擇也非常廣泛，是一種在基地上構(gòu)建多層膜的簡單方法?；趯訉幼越M裝技術(shù)的種種優(yōu)點，LBL技術(shù)構(gòu)建多層膜在生物醫(yī)療領(lǐng)域有著十分重要的臨床應(yīng)用價值。
一、LBL技術(shù)應(yīng)用
1.LBL技術(shù)改性的3D打印支架用于抗骨腫瘤治療和骨再生
首先采用3D打印技術(shù)構(gòu)建了具有良好柔韌性的明膠水凝膠支架。其次，合成了聚多巴胺雜化納米 ZIF-8 MOFs，用于負載骨誘導(dǎo)生長因子及抗腫瘤藥物。最后，利用層層自組裝技術(shù)，以酚羥基為媒介，將負載藥物的納米MOFs組裝在3D打印明膠支架表面形成雙藥物智能緩釋系統(tǒng)。通過設(shè)計不同載藥納米顆粒在支架表面的組裝次序和層數(shù)的變化得到不同的的組裝涂層，使得負載骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP-2)的pZIF-8 nanoMOFs分布在涂層最底層，而載順鉑的pZIF-8 nanoMOFs分布在涂層的表層，實現(xiàn)了順鉑和BMP-2的可控程序性釋放，從而使腫瘤治療和骨修復(fù)在時間和空間上協(xié)調(diào)匹配，達到了骨腫瘤的一體化治療的效果。
圖1 LBL用于3D打印明膠支架組裝示意圖
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2.使用LBL改性納米纖維墊加速皮膚傷口愈合并減輕過度疤痕形成
研制一種能加速傷口愈合、實現(xiàn)無疤愈合的理想創(chuàng)面敷料是眾多研究者的終極目標。采用共靜電紡絲法制備了仿生絲素(SF)/聚己內(nèi)酯(PCL)基質(zhì)，并通過靜電逐層自組裝(LBL)技術(shù)將帶正電的殼聚糖(CS)和帶負電的I型膠原(COL)沉積在納米纖維氈上。掃描電鏡圖像表明，隨著LBL工藝的進行，SF/PCL納米纖維的平均纖維直徑變大，表面出現(xiàn)了越來越多的不規(guī)則突起?；瘜W結(jié)構(gòu)和組成的研究進一步證實了CS/COL的成功沉積。抗拉強度和水接觸角試驗表明，LBL改性墊的力學性能增強，親水性良好。此外，LBL結(jié)構(gòu)墊具有良好的抗菌活性和較好的促進細胞附著、生長和增殖能力。
圖2 抗菌活性(a)金黃色葡萄球菌；(b)大腸桿菌
最終，在大鼠模型體內(nèi)創(chuàng)面愈合試驗顯示，LBL結(jié)構(gòu)墊可通過TGF-b/Smad信號通路縮短創(chuàng)面閉合時間，增加膠原蛋白生成，緩解過度瘢痕形成，顯示了納米纖維墊在皮膚再生方面的潛在應(yīng)用價值。
圖3 (a)第7天各組代表性HE染色圖；(b)第21天馬松三色染色圖；(c)有代表性的疤痕測量圖；(d)第21天各組疤痕厚度。
3.LBL結(jié)合靜電紡絲技術(shù)顯著提高絲素蛋白納米纖維的抗菌性能
通過層層自組裝(LBL)將殼聚糖(CS)和聚多巴胺(PDA)引入到電紡納米纖維SF氈中，從而獲得增強的抗菌能力和細胞相容性。沉積15個雙層后，在潮濕條件下，墊子的拉伸模量從2.16MPa(原始SF墊子)增加到4.89MPa。隨著墊子上更多的雙層涂層，還探究了材料的親水性。此外，LBL結(jié)構(gòu)墊對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌能力提高了98％以上。另外，在L929細胞的增殖實驗中觀察到生物相容性的提高。
圖4 不同墊層上活細胞(綠色)和死細胞(紅色)的熒光顯微圖(a)陽性對照組；(b)SF；(c)(cs/PDA)5；(d)(CS/PDA)10；(e)(CS/PDA)15；(f)陰性對照組。
4.LBL沉積制備葡萄糖胺/膠原組裝仿生納米纖維墊用于軟骨工程
選擇力學性能良好的聚己內(nèi)酯(PCL)作為底物，將具有軟骨保護功能的d-氨基葡萄糖(GAS)和I型膠原(COL)涂覆在PCL納米纖維表面。LBL組裝后，GAS/COL成功沉積，力學性能改善，表面親水性顯著改善。LBL結(jié)構(gòu)墊可誘導(dǎo)GlcAT-I表達并降低IL-1β誘導(dǎo)的rAC中白細胞介素-1β(IL-1β)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP13)的表達。此外，SCID小鼠的皮下模型進一步證實了GAS/COL修飾的PCL墊可以促進rAC的GAG產(chǎn)生和II型膠原蛋白表達。
圖5 (a, b)細胞活力結(jié)果和；(c)rACs在制備的PCL墊和LBL修飾墊上的代表性的SEM圖。
5.殼聚糖/膠原蛋白多層LBL改性納米纖維墊增強的細胞相容性
通過共靜電紡絲制造了具有優(yōu)異機械性能的聚己內(nèi)酯和尼龍 6 纖維墊。然后通過逐層(LBL)技術(shù)將具有抗菌性能的帶正電荷的殼聚糖和具有良好生物相容性的帶負電荷的膠原組裝在納米纖維墊上。LBL改性后纖維墊的組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化。細胞生物學實驗表明，LBL修飾降低了纖維墊的細胞毒性，提高了其生物相容性。此外，LBL結(jié)構(gòu)的纖維墊可以促進細胞生長、增殖和粘附?？咕囼炞C實了其優(yōu)異的抗菌活性。
圖6 (a)L929成纖維細胞的FE-SEM形態(tài)；(b)L929細胞在不同基質(zhì)上體外培養(yǎng)3d后的DAPI圖像。
二、總結(jié)
層層自組裝技術(shù)作為生物醫(yī)藥領(lǐng)域的一項新興技術(shù)，經(jīng)過多年不斷的更新和發(fā)展逐漸成熟起來，其在基礎(chǔ)性研究中取得突破性進展的同時，將基礎(chǔ)性研究的成果逐步進行體內(nèi)/外效果測試、評價，并運用于臨床，其研究與開發(fā)對拓展高性能生物醫(yī)用材料具有重要的理論意義和現(xiàn)實價值。
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