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新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約為60~140nm。具有5個(gè)必需基因，分別針對(duì)核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）4種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因組構(gòu)成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E），病毒包膜包埋有基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。

實(shí)驗(yàn)室檢查包括一般檢查，病原學(xué)及血清學(xué)檢查，胸部影像學(xué)檢查等。病原學(xué)檢查又包括核酸檢測(cè)和抗原檢測(cè)。

本文適用于以抗原抗體反應(yīng)為原理，對(duì)鼻拭子、咽拭子、鼻咽拭子等上呼吸道樣本中的新型冠狀病毒(2019-nCoV )抗原進(jìn)行體外定性的檢測(cè)試劑的研發(fā)。

新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測(cè)試劑盒（膠體金法）。根據(jù)《體外診斷試劑分類(lèi)規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類(lèi)體外診斷試劑管理，分類(lèi)編碼為6840。

 

一. 新型冠狀病毒（2019-nCoV）抗原檢測(cè)試劑研發(fā)實(shí)驗(yàn)要求

 

1. 分析性能研究

開(kāi)發(fā)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，確定具體研究方法、試驗(yàn)方案、試驗(yàn)數(shù)據(jù)、統(tǒng)計(jì)分析等詳細(xì)內(nèi)容。

如產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要開(kāi)展在不同機(jī)型上進(jìn)行評(píng)估的研究。如產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對(duì)各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗(yàn)證。對(duì)于不同的樣本類(lèi)型應(yīng)分別開(kāi)展相應(yīng)的分析性能評(píng)估研究。配套的不同保存液或裂解液至少應(yīng)進(jìn)行檢出限、精密度、包容性、干擾研究。

分析性能評(píng)估所用樣本的基本信息均需明確，例如樣本來(lái)源、樣本類(lèi)型、采集和處理方式、稀釋方式、定值過(guò)程及數(shù)據(jù)等。研究中采用的新型冠狀病毒樣本，應(yīng)采用合理方法對(duì)樣本進(jìn)行標(biāo)定，包括拷貝數(shù)、Ct值、TCID₅₀值等。分析性能評(píng)估用樣本應(yīng)為真實(shí)樣本或病毒培養(yǎng)物，如需稀釋?xiě)?yīng)采用陰性基質(zhì)進(jìn)行稀釋。

建議著重對(duì)以下分析性能進(jìn)行研究：

1.1、樣本穩(wěn)定性

應(yīng)充分考慮實(shí)際使用過(guò)程中樣本采集、處理、運(yùn)輸及保存等各個(gè)階段的條件，對(duì)不同類(lèi)型樣本的穩(wěn)定性分別進(jìn)行研究。內(nèi)容包括建議的保存條件、保存液、裂解液和運(yùn)輸條件（如涉及）等。如樣本采集后需加入保存液、裂解液等，應(yīng)同時(shí)對(duì)處理后的樣本進(jìn)行樣本穩(wěn)定性的研究。建議對(duì)不同的滅活方式進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2、 適用的樣本類(lèi)型

列明產(chǎn)品適用的樣本類(lèi)型。

1.3 、精密度

應(yīng)對(duì)精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。

應(yīng)考慮運(yùn)行、時(shí)間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計(jì)合理的精密度試驗(yàn)方案進(jìn)行評(píng)價(jià)。

設(shè)定合理的精密度評(píng)價(jià)周期，例如：為期至少20天的檢測(cè)，具體方案可參考性能評(píng)價(jià)相關(guān)文件進(jìn)行。

用于精密度評(píng)價(jià)的臨床樣本應(yīng)至少包含3個(gè)水平：陰性樣本、臨界陽(yáng)性樣本、（中或強(qiáng)）陽(yáng)性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫螅?/span>

①陰性樣本：待測(cè)物濃度低于檢出限或?yàn)榱銤舛龋幮詸z出率應(yīng)為100%（n≥20）。

②臨界陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽(yáng)性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。

③中/強(qiáng)陽(yáng)性樣本：待測(cè)物濃度呈中度到強(qiáng)陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為100%且CV≤15%（n≥20）,或條帶結(jié)果顯色均一。

1.4 、包容性

使用具有時(shí)間和區(qū)域特征性的不同來(lái)源的至少10例樣本進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證內(nèi)容應(yīng)包括重復(fù)性、檢出限等，提供樣本及濃度的確認(rèn)方法、試驗(yàn)數(shù)據(jù)。樣本應(yīng)覆蓋目前國(guó)內(nèi)變異株的常見(jiàn)類(lèi)型，以考察對(duì)不同變異株的檢出能力。

1.5、 檢出限

1.5.1、檢出限的確定

建議對(duì)病毒進(jìn)行梯度稀釋后研究確定檢出限，每個(gè)梯度的病毒稀釋液重復(fù)3～5份，每份稀釋液重復(fù)檢測(cè)不少于20次，將具有95%陽(yáng)性檢出率的病毒水平作為檢出限。

應(yīng)分別選擇不同來(lái)源具有代表性的3個(gè)樣本進(jìn)行檢出限的確定。

1.5.2、檢出限的驗(yàn)證

選擇具有時(shí)間和區(qū)域特征性的至少3個(gè)樣本（與檢出限確定不同樣本）在檢出限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，應(yīng)達(dá)到95%陽(yáng)性檢出率。

應(yīng)提供詳細(xì)的病毒滴度的確定方法，同時(shí)應(yīng)詳細(xì)描述病毒樣本的確認(rèn)方法及驗(yàn)證結(jié)果。

1.6、 分析特異性

1.6.1、交叉反應(yīng)驗(yàn)證

地方性人類(lèi)冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）；SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒。

H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒）、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，副流感病毒Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，呼吸道合胞病毒A、B型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸病毒A、B、C、D組，EB病毒、麻疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、人偏肺病毒。

肺炎支原體、肺炎衣原體、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌、白色念珠菌。

驗(yàn)證不少于20份正常人樣本。

除SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒可采用重組蛋白外，各病原體均應(yīng)采用臨床樣本或培養(yǎng)物進(jìn)行驗(yàn)證。提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病原體樣本的來(lái)源、陰陽(yáng)性、種屬/型別和濃度/滴度確認(rèn)等試驗(yàn)資料。建議在病原體的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證，如病毒濃度為10⁵ pfu/mL或更高。

1.6.2、內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾

建議在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行評(píng)價(jià)，在病毒抗原臨界陽(yáng)性水平進(jìn)行干擾試驗(yàn)驗(yàn)證。

 

表1 用于干擾試驗(yàn)的物質(zhì)

物質(zhì)	活性成分
粘蛋白	純化粘蛋白
血液	/
抗病毒藥物	α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋、阿比多爾
抗生素	左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、美羅培南
全身性抗菌藥	妥布霉素
過(guò)敏性癥狀緩解藥物	鹽酸組胺
鼻腔噴霧劑或滴鼻劑	苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑）
鼻用皮膚類(lèi)固醇	倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、    布地奈德、莫米松、氟替卡松

 

1.7 、高劑量鉤狀效應(yīng)

應(yīng)評(píng)估高劑量鉤狀效應(yīng)并開(kāi)展研究。

1.8、根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對(duì)企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗(yàn)。

1.9 、反應(yīng)體系

1.9.1、反應(yīng)條件確定：開(kāi)發(fā)人應(yīng)考慮反應(yīng)時(shí)間、判讀時(shí)間、反應(yīng)溫度、洗滌液體積和洗滌次數(shù)（如涉及）等條件對(duì)產(chǎn)品性能的影響，通過(guò)試驗(yàn)確定上述條件的最佳組合。

1.9.2、反應(yīng)體系中樣本加樣方式及加樣量確定：通過(guò)試驗(yàn)確定最佳的加樣方式及加樣量。如樣本需采取稀釋或其他必要的方法進(jìn)行處理后方可用于最終檢測(cè)，還應(yīng)對(duì)樣本稀釋液及其用量、其他必要的處理方法等進(jìn)行研究。

1.9.3、采樣拭子及樣本保存液的選擇：對(duì)拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。

 

2. 穩(wěn)定性研究

穩(wěn)定性研究主要包括實(shí)時(shí)穩(wěn)定性（有效期）、開(kāi)瓶（開(kāi)封）穩(wěn)定性、高溫加速破壞穩(wěn)定性、運(yùn)輸穩(wěn)定性等，開(kāi)發(fā)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。對(duì)于實(shí)時(shí)穩(wěn)定性研究，應(yīng)提供至少三批樣品在實(shí)際儲(chǔ)存條件下保存至成品有效期后的研究。

 

3. 陽(yáng)性判斷值研究

開(kāi)展對(duì)申報(bào)試劑陰性/灰區(qū)/陽(yáng)性等結(jié)果判斷的陽(yáng)性判斷值（cut-off,CO）確定的研究。建立陽(yáng)性判斷值使用的樣本來(lái)源的選擇應(yīng)考慮到不同的地理區(qū)域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素的影響。如果產(chǎn)品適用不同樣本類(lèi)型，需要對(duì)所有樣本類(lèi)型進(jìn)行陽(yáng)性判斷值的驗(yàn)證。

如適用，可采用受試者工作特征曲線（receiver operating characteristic curve, ROC）的分析方式來(lái)選擇確定合理的陽(yáng)性判斷值；如結(jié)果存在灰區(qū)（equivocal zone），應(yīng)明確灰區(qū)建立的基礎(chǔ)。如采用其他方法對(duì)陽(yáng)性判斷值進(jìn)行確認(rèn)研究，應(yīng)說(shuō)明這種方法的合理性。

 

4. 其他研究

4.1、主要原材料研究

此產(chǎn)品的主要原材料包括抗體、質(zhì)控品（線）、參考品等。應(yīng)對(duì)主要原材料的選擇與來(lái)源、制備過(guò)程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)開(kāi)展研究。如主要原材料為企業(yè)自制，應(yīng)明確其詳細(xì)制備過(guò)程；如主要原材料源于外購(gòu)，應(yīng)明確選擇該原材料的依據(jù)及開(kāi)展對(duì)比篩選試驗(yàn)、供應(yīng)商提供的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、出廠檢驗(yàn)報(bào)告，以及檢驗(yàn)該原材料到貨后的質(zhì)量，供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。

4.1.1、新型冠狀病毒特異的抗體

病原體特異的抗體是該類(lèi)產(chǎn)品的關(guān)鍵原材料。在選擇抗體原料時(shí)，應(yīng)注重結(jié)合表位的選擇，避免毒株間差異造成的假陰性，亦應(yīng)考慮抗原在其他冠狀病毒的表達(dá)情況，避免存在交叉反應(yīng)出現(xiàn)假陽(yáng)性。

應(yīng)開(kāi)展抗體來(lái)源、制備、篩選、鑒定及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（外觀、蛋白濃度、純度、分子量、效價(jià)、功能性試驗(yàn)等）等試驗(yàn)。

自制抗體，如使用天然抗原作為免疫原，應(yīng)明確該天然抗原的來(lái)源；如使用重組抗原或其他人工合成抗原作為免疫原，應(yīng)明確相應(yīng)的核酸或者蛋白序列信息。針對(duì)抗體的制備、鑒定等過(guò)程，應(yīng)開(kāi)展詳細(xì)的研究和工藝穩(wěn)定性驗(yàn)證。

外購(gòu)抗體，應(yīng)詳述抗體的名稱(chēng)及生物學(xué)來(lái)源，供應(yīng)商名稱(chēng)；開(kāi)展供應(yīng)商選擇的研究及供應(yīng)商出具的抗體性能指標(biāo)及檢驗(yàn)報(bào)告。

4.1.2、其他主要原材料

除上述主要原材料外，產(chǎn)品中包含的其他主要原材料，如二級(jí)抗體、膠體金、發(fā)光物、硝酸纖維素膜、微孔板、樣本稀釋液、提取液等，均應(yīng)進(jìn)行選擇及驗(yàn)證。明確供應(yīng)商和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

4.1.3、試劑盒質(zhì)控品/質(zhì)控線

產(chǎn)品應(yīng)設(shè)置合理的質(zhì)控品/質(zhì)控線。質(zhì)控品應(yīng)至少包含陰性和陽(yáng)性兩個(gè)水平。對(duì)相關(guān)原料的來(lái)源、選擇和性能確認(rèn)等相關(guān)內(nèi)容開(kāi)展研究，明確供應(yīng)商和質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。開(kāi)發(fā)人應(yīng)對(duì)質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果做出明確的范圍要求（試驗(yàn)有效性的判斷）。

4.1.4、企業(yè)參考品

該類(lèi)產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽(yáng)性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗(yàn)證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。

應(yīng)明確企業(yè)參考品的原料來(lái)源、選擇、制備、陰陽(yáng)性及濃度/滴度確認(rèn)方法或試劑等相關(guān)驗(yàn)證。企業(yè)參考品應(yīng)采用臨床樣本，或者使用病毒培養(yǎng)液加入陰性基質(zhì)。企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：

4.1.4.1、陽(yáng)性參考品

陽(yáng)性參考品應(yīng)考慮覆蓋不同來(lái)源及特征的樣本，可選擇至少各5份確認(rèn)為陽(yáng)性的樣本，并設(shè)置不同滴度水平。

4.1.4.2、陰性參考品

陰性參考品應(yīng)考慮檢測(cè)特異性的評(píng)價(jià)，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、流感病毒、腸道病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等抗原陽(yáng)性樣本。

4.1.4.3、檢出限參考品

可設(shè)置系列稀釋樣本，其中應(yīng)包含檢出限水平。

4.1.4.4、重復(fù)性參考品

建議包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中一個(gè)濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。

4.2、生產(chǎn)工藝的研究

4.1.1、明確產(chǎn)品基本反應(yīng)原理。

4.1.2、明確主要生產(chǎn)工藝的依據(jù)。

4.1.3、應(yīng)考慮如包被/標(biāo)記液量、濃度、時(shí)間、條件等指標(biāo)對(duì)產(chǎn)品性能的影響，通過(guò)試驗(yàn)確定上述指標(biāo)的最佳組合。

4.1.4、顯色系統(tǒng)、酶作用底物等的介紹以及最適條件研究。