新型冠狀病毒（2019-nCoV）屬于β屬冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，直徑約為60~140nm。具有5個必需基因，分別針對核蛋白（N）、病毒包膜（E）、基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）4種結(jié)構(gòu)蛋白及RNA依賴性的RNA聚合酶（RdRp）。核蛋白（N）包裹RNA基因組構(gòu)成核衣殼，外面圍繞著病毒包膜（E）,病毒包膜包埋有基質(zhì)蛋白（M）和刺突蛋白（S）等蛋白。
實(shí)驗室檢查包括一般檢查，病原學(xué)及血清學(xué)檢查，胸部影像學(xué)檢查等。病原學(xué)檢查又包括核酸檢測和抗原檢測。核酸檢測主要采用逆轉(zhuǎn)錄PCR，二代測序等方法，在鼻、口咽拭子、痰液和其他下呼吸道分泌物等標(biāo)本中均可檢測出新型冠狀病毒核酸。
新型冠狀病毒在流行過程中基因組不斷發(fā)生變異，新的變異株可能在傳播力、致病性、免疫逃逸能力等方面發(fā)生改變。變異株可能影響檢測試劑的性能，甚至出現(xiàn)漏檢。
本文適用于采用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光 PCR法，對咽拭子、鼻咽拭子、肺泡灌洗液或痰液等呼吸道樣本中的新型冠狀病毒(2019-nCoV )核酸進(jìn)行體外定性的檢測試劑。
根據(jù)《體外診斷試劑分類規(guī)則》，該產(chǎn)品按照第三類體外診斷試劑管理，分類編碼為6840。
一. 新型冠狀病毒（2019-nCoV）核酸檢測試劑性能研究實(shí)驗要求
1. 分析性能研究
開發(fā)人應(yīng)采用在符合質(zhì)量管理體系的環(huán)境下生產(chǎn)的試劑盒進(jìn)行所有分析性能研究，確定具體研究方法、試驗方案、試驗數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析等。
如產(chǎn)品適用不同的機(jī)型，需要對采用不同機(jī)型進(jìn)行性能評估。如申報產(chǎn)品包含不同的包裝規(guī)格，需要對各包裝規(guī)格進(jìn)行分析或驗證。
適用的不同樣本類型應(yīng)分別進(jìn)行分析性能研究。
1.1樣本穩(wěn)定性
考慮到病毒RNA極易被降解的特性，應(yīng)對樣本穩(wěn)定性進(jìn)行詳細(xì)研究，包括采集后未經(jīng)處理的樣本，加入不同裂解液/消化液的樣本，滅活處理后的樣本，研究內(nèi)容包括冷藏保存時間，冷凍保存時間，凍融次數(shù)等。
如產(chǎn)品適用拭子、痰液等不同的樣本類型，因其中干擾物質(zhì)存在較大差異，可能對病毒RNA降解的影響不同，建議對每種樣本類型均進(jìn)行穩(wěn)定性研究。
如核酸提取液可不立即進(jìn)行檢測，還需對核酸提取液的保存條件和穩(wěn)定性進(jìn)行研究。
1.2適用的樣本類型
明確產(chǎn)品適用的樣本類型。
1.3企業(yè)參考品驗證
根據(jù)主要原材料研究資料中的企業(yè)參考品設(shè)置情況，采用三批產(chǎn)品對企業(yè)參考品進(jìn)行檢驗并提供詳細(xì)的試驗數(shù)據(jù)。
1.4精密度
應(yīng)對精密度指標(biāo)，如標(biāo)準(zhǔn)差或變異系數(shù)等的評價標(biāo)準(zhǔn)做出合理要求。應(yīng)考慮運(yùn)行、時間、操作者、儀器、試劑批次和地點(diǎn)等影響精密度的條件，設(shè)計合理的精密度試驗方案進(jìn)行評價。精密度評價試驗應(yīng)包含核酸提取步驟。設(shè)定合理的精密度評價周期，例如為期至少20天的檢測。對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，獲得重復(fù)性、實(shí)驗室內(nèi)精密度、實(shí)驗室間精密度、批間精密度等結(jié)果。
采用臨床樣本進(jìn)行精密度評價，應(yīng)至少包含3個水平：陰性樣本、臨界陽性樣本、中/強(qiáng)陽性樣本，并根據(jù)產(chǎn)品特性設(shè)定適當(dāng)?shù)木芏纫?，例如?/span>
陰性樣本：待測物濃度低于檢出限或為零濃度，陰性檢出率應(yīng)為100%（n≥20）。
臨界陽性樣本：待測物濃度略高于試劑盒的檢出限，陽性檢出率應(yīng)≥95%（n≥20）。
中/強(qiáng)陽性樣本：待測物濃度呈中度到強(qiáng)陽性，陽性檢出率為100%且Ct值的CV≤5%（n≥20）。
1.5包容性
1.5.1病毒樣本的驗證
驗證具有時間和區(qū)域特征性的至少20個不同來源的陽性樣本（臨床樣本或病毒培養(yǎng)物），應(yīng)包括檢出限和重復(fù)性的驗證。樣本應(yīng)覆蓋目前國內(nèi)流行的變異株型別，并適當(dāng)納入其他代表性的變異株。注意包容性研究樣本和檢出限研究樣本不能重復(fù)。
1.5.2生物信息學(xué)分析及人工合成樣本的驗證
按照器審中心另行公布的變異株驗證相關(guān)要求進(jìn)行評價。
1.6檢出限
1.6.1檢出限的確定
將不同來源的至少5個新冠病毒樣本梯度稀釋于與適用樣本一致的基質(zhì)中，進(jìn)行檢出限的確定。每個濃度梯度最少重復(fù)3次檢測，以100%可檢出的最低濃度水平作為估計檢出限，在此濃度附近制備若干梯度濃度樣本，每個濃度至少重復(fù)20次檢測，將具有95%陽性檢出率的最低濃度水平作為確定的檢出限。
1.6.2檢出限的驗證
選擇另外5個不同來源的新冠病毒樣本在檢出限濃度水平進(jìn)行驗證，應(yīng)達(dá)到95%陽性檢出率。
1.7分析特異性
1.7.1交叉反應(yīng)
需驗證相關(guān)病原體和多例人類基因組DNA（表1）的交叉反應(yīng)。除SARS冠狀病毒和MERS冠狀病毒可采用假病毒外，各病原體均應(yīng)采用臨床樣本或培養(yǎng)物進(jìn)行驗證。建議在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗證。通常，細(xì)菌感染的濃度水平為106CFU/mL或更高，病毒為105PFU/mL或更高，明確所有用于交叉反應(yīng)驗證的病原體樣本的來源、陰陽性、種屬/型別和濃度等。
表1 需進(jìn)行交叉反應(yīng)驗證的物質(zhì)
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地方性人類冠狀病毒（HKU1，OC43，NL63和229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒 |
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H1N1（新型甲型H1N1流感病毒（2009）、季節(jié)性H1N1流感病毒、H3N2、H5N1、H7N9，乙型流感Yamagata、Victoria，呼吸道合胞病毒A、B型，副流感病毒1、2、3型，鼻病毒A、B、C組，腺病毒1、2、3、4、5、7、55型，腸道病毒A、B、C、D組，人偏肺病毒、EB病毒、麻疹病毒、人巨細(xì)胞病毒、輪狀病毒、諾如病毒、腮腺炎病毒、水痘-帶狀皰疹病毒 |
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肺炎支原體、肺炎衣原體 |
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軍團(tuán)菌、百日咳桿菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、化膿性鏈球菌、肺炎克雷伯菌、結(jié)核分枝桿菌 |
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煙曲霉、白色念珠菌、光滑念珠菌、新生隱球菌等 |
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高濃度人類基因組DNA |
1.7.2競爭性干擾
開發(fā)人應(yīng)充分考慮臨床上容易與新冠病毒合并感染的病原體，在高濃度的情況下對低濃度（例如檢出限濃度）新冠病毒核酸檢測的影響，進(jìn)行競爭性干擾研究。
1.7.3干擾試驗
應(yīng)根據(jù)所采集樣本類型，針對可能存在的內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾情況進(jìn)行驗證。在每種干擾物質(zhì)的潛在最大濃度（“最差條件”）條件下進(jìn)行試驗，檢測包含臨界陽性水平在內(nèi)的新冠病毒樣本。對結(jié)果進(jìn)行合理的統(tǒng)計分析，對比添加干擾物質(zhì)前后的 Ct 值差異。檢測的潛在干擾物包括樣本中的原有物質(zhì)及在樣本采集和處理期間引入的物質(zhì)。
表2 用于干擾試驗的物質(zhì)
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類別 |
具體物質(zhì) |
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粘蛋白 |
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血液（人類） |
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鼻腔噴霧劑或滴鼻劑 |
苯福林、羥甲唑啉、氯化鈉（含防腐劑） |
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鼻用皮膚類固醇 |
倍氯美松、地塞米松、氟尼縮松、曲安奈德、布地奈德、莫米松、氟替卡松 |
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緩解咽部癥狀的藥物 |
相關(guān)含片、噴劑等 |
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過敏性癥狀緩解藥物 |
鹽酸組胺 |
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抗病毒藥物 |
α-干擾素、扎那米韋、利巴韋林、奧司他韋、帕拉米韋、洛匹那韋、利托那韋、阿比多爾 |
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抗生素 |
左氧氟沙星、阿奇霉素、頭孢曲松、美羅培南 |
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全身性抗菌藥物 |
妥布霉素 |
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樣本采集和處理期間引入的物質(zhì) |
1.8核酸（RNA）提取/純化性能
在進(jìn)行核酸檢測之前，建議有核酸（RNA）提取/純化步驟。該步驟的目的除最大量分離出目的RNA外，還應(yīng)有相應(yīng)的純化作用，盡可能去除PCR抑制物。對配合使用的所有核酸提取試劑進(jìn)行提取核酸純度、濃度、提取效率的研究，并與質(zhì)量較好的核酸提取試劑進(jìn)行平行比對。若產(chǎn)品適用兩種或以上核酸提取試劑，則每一種核酸提取試劑均需配合檢測試劑進(jìn)行抗干擾、精密度和檢出限的驗證。
1.9反應(yīng)體系
1.9.1樣本采集和處理
1.9.1.1樣本采集方式的選擇
1.9.1.2樣本采集時間點(diǎn)的選擇：是否受病程、臨床癥狀、用藥情況等因素的影響。
1.9.1.3采樣拭子及樣本保存液的選擇：對拭子頭和拭子桿的材質(zhì)要求。明確保存液或裂解液的成分、濃度、使用量的要求等。配套的不同保存液或裂解液需驗證檢出限和重復(fù)性。
1.9.1.4樣本處理方式的選擇：研究產(chǎn)品適用的滅活方式，包括熱滅活和化學(xué)滅活，研究內(nèi)容包括胍鹽的使用濃度及用量、樣本用量。如適用，對痰液消化方式及消化液進(jìn)行研究。
1.9.2核酸提取和反應(yīng)體系
研究確定最佳核酸提取和反應(yīng)體系，包括核酸提取用的樣本體積、洗脫體積和PCR加樣體積、各種酶濃度、引物/探針濃度、dNTP濃度、陽離子濃度及反應(yīng)各階段溫度、時間、循環(huán)數(shù)等。建議在保證核酸提取質(zhì)量的情況下盡量擴(kuò)大總反應(yīng)體系和加樣量，以提高檢測靈敏度。
反應(yīng)體系研究應(yīng)確保不同基因的檢測能力具有一致性，對于結(jié)果為單基因陽性時需要復(fù)測的試劑，需使用至少10例臨床樣本梯度稀釋，觀察各基因檢出情況是否存在顯著差異，避免過高的復(fù)測率。
確定不同適用機(jī)型基線和閾值循環(huán)數(shù)。
不同適用機(jī)型的反應(yīng)條件如果有差異應(yīng)分別進(jìn)行驗證。
2. 穩(wěn)定性研究
申報試劑的穩(wěn)定性主要包括實(shí)時穩(wěn)定性（有效期）、開瓶穩(wěn)定性及凍融次數(shù)限制等研究，開發(fā)人可根據(jù)實(shí)際需要選擇合理的穩(wěn)定性研究方案。對于實(shí)時穩(wěn)定性研究，應(yīng)對至少三批產(chǎn)品在實(shí)際儲存條件下保存至成品有效期后進(jìn)行研究。
3. 陽性判斷值研究
陽性判斷值一般為申報產(chǎn)品檢測病毒核酸陽性的Ct值。陽性判斷值研究用樣本來源應(yīng)具有多樣性和代表性，考慮不同時間、地域、不同的感染階段和生理狀態(tài)等因素，盡量納入較多弱陽性和高陰性水平的樣本。在條件允許的情況下，建議覆蓋目前的流行株進(jìn)行陽性判斷值研究。采用ROC曲線分析建立每個檢測靶基因的陽性判斷值，然后確定產(chǎn)品的判讀規(guī)則（單基因陽性、雙基因陽性等）。對于結(jié)果為單基因陽性時需要復(fù)測的試劑，建議對陽性判斷值研究數(shù)據(jù)進(jìn)行復(fù)測率的統(tǒng)計分析。如判定值存在灰區(qū)，對灰區(qū)進(jìn)行確認(rèn)。
如果產(chǎn)品適用不同樣本類型，需要對各樣本類型進(jìn)行陽性判斷值的驗證。
研究確定內(nèi)標(biāo)檢測結(jié)果范圍。
4. 其他研究
4.1主要原材料研究
該類產(chǎn)品的主要原材料包括引物、探針、酶、dNTP、核酸分離/純化組分（如有）、質(zhì)控品、參考品等。應(yīng)確定主要原材料的選擇與來源、制備過程、質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)等相關(guān)研究、質(zhì)控品的定值試驗等。主要原材料可為企業(yè)自制也可源于外購。供應(yīng)商應(yīng)固定，不得隨意更換。
4.1.1引物和探針：應(yīng)明確引物、探針核酸序列、靶序列的基因位點(diǎn)及兩者的對應(yīng)情況。建議每種病毒設(shè)計兩套或多套引物、探針以供篩選，通過序列比對和功能性試驗等方式，對病毒進(jìn)行包容性和特異性（如交叉反應(yīng)）的評價，其中序列比對包括與已公布新冠病毒序列的比對，及與易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的其他病原體的序列比對；功能性試驗包括對不同來源、不同滴度的新冠病毒核酸陽性樣本，和不同的近緣病原體的檢測。通過篩選確定最佳的引物和探針組合。引物、探針的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)至少包括序列準(zhǔn)確性、純度、濃度及功能性實(shí)驗等。
4.1.2脫氧三磷酸核苷（dNTP）：包括dATP、dGTP、dCTP、dTTP、dUTP，應(yīng)對其純度、濃度、功能性等進(jìn)行驗證。
4.1.3酶：需要的酶主要包括DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、尿嘧啶DNA糖基化酶等，應(yīng)分別對酶活性、功能性等進(jìn)行評價和驗證。
4.1.4質(zhì)控品
試劑盒一般包含陰性質(zhì)控品和陽性質(zhì)控品。陽性質(zhì)控品應(yīng)包含試劑盒檢測的靶序列，可采用假病毒制備。質(zhì)控品需參與樣本處理、核酸的平行提取和檢測的全過程，以對整個提取和PCR擴(kuò)增過程、試劑/設(shè)備、交叉污染等環(huán)節(jié)進(jìn)行合理質(zhì)量控制。對質(zhì)控品的檢測結(jié)果Ct值范圍做出明確的要求。
4.1.5內(nèi)標(biāo)
內(nèi)標(biāo)，又稱內(nèi)對照，可對管內(nèi)抑制導(dǎo)致的假陰性結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，應(yīng)與靶核酸一同提取及擴(kuò)增。開發(fā)人需對內(nèi)標(biāo)的引物、探針設(shè)計和相關(guān)反應(yīng)體系的濃度做精確驗證，既要保證內(nèi)標(biāo)熒光通道呈明顯的陽性曲線又要盡量降低對靶基因檢測造成的抑制。明確內(nèi)標(biāo)的檢測結(jié)果Ct值范圍。建議科學(xué)設(shè)置內(nèi)標(biāo)，對待測樣本的取樣質(zhì)量、試劑的反應(yīng)體系進(jìn)行監(jiān)控。
4.1.6企業(yè)參考品
該類產(chǎn)品的企業(yè)參考品一般包括陽性參考品、陰性參考品、檢出限參考品和重復(fù)性參考品。應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能驗證的實(shí)際需要設(shè)置企業(yè)參考品。
企業(yè)參考品的設(shè)置建議如下：
陽性參考品：應(yīng)著重考慮不同來源的病毒樣本和滴度要求，應(yīng)至少選取不同來源的5個病毒樣本。
陰性參考品：主要涉及對交叉反應(yīng)的驗證情況，建議包括冠狀病毒（HKU1、OC43、NL63、229E）、SARS冠狀病毒（可采用假病毒）、MERS冠狀病毒（可采用假病毒）、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等。
檢出限參考品：可采用95%陽性檢出水平或略高于檢出限的水平，如100%陽性檢出水平。
重復(fù)性參考品：建議包括高、低兩個濃度的樣本，其中一個濃度應(yīng)為檢出限附近的濃度。
4.2生產(chǎn)工藝研究
明確產(chǎn)品主要生產(chǎn)工藝并進(jìn)行優(yōu)化研究。
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