在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；
緩沖液可以緩沖溶液pH的改變，緩沖液的定義是加入少量的酸或堿時能緩沖pH，就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩沖能力，它是由緩沖液的濃度和緩沖鹽的pKa決定的，緩沖鹽在pKa附近的緩沖能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩沖鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機(jī)溶劑。當(dāng)加入有機(jī)溶劑時，pKa會有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會有一樣的變化。
對于液相常用濃度來說，緩沖液應(yīng)維持在緩沖鹽的pKa的1.5個pH單位左右，當(dāng)濃度特別稀的時候，如低于5mM，就要把范圍縮小，大概+/-1個pH單位。
表1：常用緩沖鹽的pKa值（25℃）
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緩沖鹽 |
pKa |
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醋酸鹽 |
4.75 |
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銨鹽 |
9.24 |
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硼酸鹽1 |
9.24 |
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硼酸鹽2 |
12.74 |
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硼酸鹽3 |
13.8 |
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檸檬酸鹽1 |
3.13 |
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檸檬酸鹽2 |
4.76 |
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檸檬酸鹽3 |
6.4 |
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2-(N-嗎啉代)乙磺酸(MES) |
6.15 |
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草酸鹽1 |
1.27 |
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草酸鹽2 |
4.27 |
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磷酸鹽1 |
2.15 |
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磷酸鹽2 |
7.2 |
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磷酸鹽3 |
12.38 |
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三氯乙酸 |
0.52 |
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三乙醇胺 |
7.76 |
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三乙胺 |
10.72 |
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三氟乙酸 |
0.5 |
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三羥甲基氨基甲烷(Tris) |
8.08 |
建議在開發(fā)方法的時候首先要選擇緩沖鹽和 pH范圍，然后用溶液的選擇性微調(diào)分離。這個策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩沖液pH的泥潭。
溫度
1）建議溫度設(shè)置在25℃-40℃，適當(dāng)?shù)闹鶞乇３至己玫谋Ａ魰r間的重現(xiàn)性，一定程度上提高柱效，增加分離度。
2）柱溫過低，流動相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。
3）柱溫太高，與檢測器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對試劑或緩沖鹽對硅膠基質(zhì)的攻擊，硅膠溶解，縮短色譜柱的壽命；柱溫太低，使得需要制冷的柱溫箱，硬件要求太高，不利于方法的推廣。
4）溫度的改變會導(dǎo)致保留時間漂移，如果儀器自動進(jìn)樣過夜或過周末，就會發(fā)現(xiàn)保留時間隨著實(shí)驗(yàn)室溫度的改變而產(chǎn)生漂移，顯然這種問題用柱溫箱就可以避免。
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