據(jù)初步統(tǒng)計(jì)，目前中國(guó)糖尿病患者人數(shù)是1.14億，患病率高達(dá)11.6%，位居世界第一，糖尿病并發(fā)癥發(fā)病率達(dá)到90%。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道男性糖友性功能低下或ED約50%以上，服用西地那非無(wú)效。迄今糖尿病治療僅局限于控制血糖，對(duì)治療糖尿病并發(fā)癥仍無(wú)能為力。項(xiàng)目發(fā)明人叢曉東與中國(guó)藥科大學(xué)團(tuán)隊(duì)歷經(jīng)30年研發(fā)，挖掘中醫(yī)藥寶庫(kù)，聚焦于糖尿病和糖尿病并發(fā)癥原研藥的開發(fā)，從中藥大黃中發(fā)現(xiàn)的天然產(chǎn)物大精酸，用于糖尿病并發(fā)癥。2005-2006年進(jìn)行臨床前研究，藥學(xué)方面取得了積極進(jìn)展；2007年與中國(guó)藥科大學(xué)戴德哉教授合作對(duì)藥理藥效、作用機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，藥效成果獲國(guó)際醫(yī)藥專家的認(rèn)可，并陸續(xù)公開了一些數(shù)據(jù)。
目前獲得重大突破，取得：（1）中國(guó)、歐、美、日、俄發(fā)明專利證書；（2）糖尿病并發(fā)癥的新作用機(jī)制及藥效獲國(guó)際醫(yī)藥專家的認(rèn)可，在國(guó)際著名核心期刊SCI公開10多篇研究報(bào)告；（3）項(xiàng)目列為國(guó)家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項(xiàng)立項(xiàng)，2017ZX09301066。
今天推薦一篇2013年在歐洲藥理學(xué)雜志發(fā)表的一篇文章，“大精酸通過(guò)抑制ERS和IκBβ—治療男性糖尿病ED”，當(dāng)年點(diǎn)擊率破歷史記錄，雜志總編特地發(fā)來(lái)賀信表示祝賀。該論文曾在2009年國(guó)際第一屆天然藥物與藥理學(xué)術(shù)大會(huì)主題講演，并獲特別大獎(jiǎng)。
摘要
2型糖尿病常伴有男性性功能減退（糖尿病ED），是由于睪丸功能障礙，但發(fā)病機(jī)制的起源尚不清楚。本文采用高脂飲食（HFD）和低劑量鏈脲佐菌素（STZ）制作2型糖尿病大鼠，建立糖尿病睪丸病模型，評(píng)價(jià)促炎癥因子參與機(jī)制，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激，和核κBβ抑制因子（IκBβ），證明炎癥因子介導(dǎo)糖尿病男性性功能低下的機(jī)制并觀察大精酸的藥效。糖尿病大鼠血中睪酮和促黃體激素（LH）減少，同時(shí)觀察到生成睪酮的關(guān)鍵蛋白-類固醇合成觸發(fā)調(diào)節(jié)蛋白（StAR）的降低，和反映2型糖尿病特點(diǎn)的胰島素受體底物（IRS-1）的降低，被激活的核κBβ抑制因子（IκBβ）和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激因子，伴侶同源蛋白（CHOP）等炎癥因子的降低。在體試驗(yàn)還觀察到：精子計(jì)數(shù)和活動(dòng)力均明顯降低和性行為明顯減少。
另外，高糖培養(yǎng)睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells）的體外試驗(yàn)出現(xiàn)上調(diào)的：IκBβ，ER應(yīng)激傳感器PERK（PKR 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶）和磷酸化 Akt/ Akt 的蛋白比值。這些變化可能是由于炎癥中的炎癥因子與活化的NADPH氧化酶有關(guān)，大精酸能顯著緩解這些變化?？傊筛咧嬍澈偷蛣┝?STZ誘發(fā)的糖尿病睪丸病具有炎癥實(shí)體特征，大精酸通過(guò)使活化的IκBβ和ER應(yīng)激的正?；?，可完全緩解糖尿病陽(yáng)痿。
1.前言
男性性腺機(jī)能減退常繼發(fā)于二型糖尿病病。誘發(fā)男性性腺功能減退的病變可能包括氧化應(yīng)激和凋亡變化，這可在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病試驗(yàn)病中觀察到(Tang等，2008)。低烈度被認(rèn)為是糖尿病的一個(gè)重要潛在機(jī)制(Romeo et al., 2012)；一些促炎/促炎因子(包括內(nèi)皮-1 (ET-1)和NADPH氧化酶)的變化可能會(huì)導(dǎo)致受影響睪丸的病變(Cheng et al., 2010)。線粒體異常和NADPH氧化酶激活有助于活性氧的生成，從而通過(guò)未折疊的蛋白反應(yīng)和隨后的ER應(yīng)激導(dǎo)致ER(內(nèi)質(zhì)網(wǎng))中異常蛋白的積累(Zhang, 2010)。盡管輕度ER應(yīng)激可能有利于維持胰腺β細(xì)胞中的胰島素生物合成(Kaufman et al., 2010)，但持續(xù)的ER應(yīng)激會(huì)損害受影響的細(xì)胞，因此需要降低ER應(yīng)激來(lái)挽救β細(xì)胞群和糖尿病腎臟(Tirupathi Pichiah et al., 2011; Hu et al., 2011)
內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激的特征是核轉(zhuǎn)錄因子（IκBβ）如類ER激酶(PERK)和C/EBP同源蛋白(CHOP)的上調(diào)，表明疾病中隱含的低烈度炎癥反應(yīng)(Zhang，2010；Kaufman等人，2010年)。ER應(yīng)激對(duì)于降低缺氧睪丸中睪酮的生物合成至關(guān)重要(Liu等人，2012)，并且與2型糖尿病伴胰島素抵抗的并發(fā)癥有關(guān)(Hu等人，2011；McAlpine等人，2010年)。在糖尿病腎臟中發(fā)現(xiàn)的ER應(yīng)激是由高劑量的STZ(鏈脲佐菌素，65 mg/kg，i.p .)在大鼠中產(chǎn)生的，類似于臨床觀察到的1型糖尿病(Hu等人，2011年)。然而，更令人感興趣的是在由高脂肪飲食和低劑量的產(chǎn)生的大鼠模型中研究糖尿病ED的變化(Zhang等人，2006；Sharma等人，2011年)。單獨(dú)喂食高脂肪食物的兔子可能表現(xiàn)出勃起功能障礙和睪丸異常(Filippi等人，2009年；Mallidis等人，2011年)。ER應(yīng)激是否在2型糖尿病大鼠的雄性性腺功能減退中起關(guān)鍵作用仍有待確定。
胰島素受體底物-1 (IRS-1)是一種介導(dǎo)代謝綜合征的胞質(zhì)銜接蛋白，代表細(xì)胞內(nèi)胰島素流動(dòng)的敏感性。IRS-1在睪丸支持細(xì)胞、早期精母細(xì)胞、腎小管周肌樣細(xì)胞和睪丸內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，反映了睪丸中的臨界胰島素流量(Kokk等人，2007)。結(jié)果表明IRS-1升高是治療2型糖尿病大鼠的有效療法(Si等人，2012年)。因此，IRS-1下調(diào)可能是胰島素受體敏感性下降和睪丸功能障礙減少的信號(hào)。脂肪組織釋放的瘦素會(huì)增加炎癥因子(如IL-8)的水平，并可能影響IRS-1和Akt途徑(Tong等人，2008)。有趣的是要確定上調(diào)的瘦素受體(OBRb)是否可能反映2型糖尿病睪丸病中IRS-1的減少。在糖尿病患者中，NFκB與淋巴單核細(xì)胞積極相關(guān)，表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸抑制上調(diào)的NFκB (Amore等人，2012年)。在HFD和低STZ誘發(fā)的2型糖尿病大鼠中，尚不確定這些異常是否與炎癥有關(guān)(涉及睪丸中IκBβ的上調(diào))，并且可能被抗炎癥藥物減輕。
大精酸Argirein具有抗炎活性，因此通過(guò)其抗炎活性減輕糖尿病腎病(高等人，2010；胡等，2011)。我們假設(shè)HFD和低STZ導(dǎo)致的糖尿病睪丸損傷誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，包括活化的IκBβ和ER應(yīng)激伴侶蛋白伴隨著降低的IRS-1，以及睪丸中異常的PPARα/γ(過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α/γ)、MMP2/9（基質(zhì)金屬蛋白酶）和Cx40/43（間隙連接蛋白）。大精酸的抗炎活性可能會(huì)減輕這些變化。血管緊張素-II (A II)是刺激NADPH氧化酶激活產(chǎn)生活性氧的關(guān)鍵介質(zhì)(Cabello-Verrugio等人，2011年)，纈沙坦阻斷血管緊張素-2受體可抑制NADPH氧化酶及其相關(guān)的炎癥反應(yīng)。因此，我們測(cè)試了大精酸是否可以通過(guò)抑制炎癥/促炎癥因子來(lái)緩解2型糖尿病睪丸病。
2.材料和方法
2.1 材料
大精酸自制，STZ購(gòu)自適馬公司。MMLV RT(莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶；Pro- mega，Madison，WI)和Taq DNA聚合酶(天根生物技術(shù)公司，中國(guó)北京)購(gòu)自中國(guó)南京的天威公司。購(gòu)自美國(guó)加州圣克魯斯的一級(jí)抗體有:StAR、CHOP、PERK、IRS-1、MMP-2、PPARα、PPARγ、p-Akt、Akt；和來(lái)自Bosta，Co .:的是MMP-2、MMP-9、Cx40、Cx43，來(lái)自Abcam的是OBRb。HRP綴合的多克隆山羊抗小鼠IgG和多克隆山羊抗兔IgG購(gòu)自中國(guó)武漢的Boster Biological Technology。
2.2 .動(dòng)物
成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體重200-220g，從浙江省杭州市的浙江實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心獲得，許可證號(hào)為SCXK20080033。動(dòng)物處理程序得到了國(guó)家自然科學(xué)基金會(huì)和大學(xué)科學(xué)部的批準(zhǔn)，對(duì)大鼠的處理嚴(yán)格遵守中國(guó)江蘇省科技局制定的處理實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指南。
2.3 .高脂肪飲食和STZ注射大鼠中的糖尿病
給雄性Sprague-Dawley大鼠喂食高脂肪飲食(HFD)和低劑量的STZ，以建立2型糖尿病大鼠模型稍作修改(張等人，2006年；Si等人，2012年)。用含10%蔗糖、10%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽固醇和74.5%基礎(chǔ)飼料的HFD喂養(yǎng)大鼠，購(gòu)自南京青龍山動(dòng)物中心。給大鼠喂食HFD 22克/天，相反，在正常情況下限制食物(普通食物15克/只)。普通飼料由36%玉米、23%研磨小麥、10%麩皮、12%大豆粉、3%雞蛋組成；12%的魚粉、2%的干酵母、1%的碳酸氫鈣混合物、多種維生素和微量元素。在為期12周的實(shí)驗(yàn)期間，用限制性普通食物喂養(yǎng)的大鼠表現(xiàn)出正常的體重增加和糖尿病大鼠相對(duì)良好的健康狀況。限制食物有利于減少胰島的糖脂毒性(徐等人，2009；胡等，2011)。
將大鼠分為7組:對(duì)照組、未治療的糖尿病組和用纈沙坦(Val，12)和大精酸(AR，50，100，200)治療的糖尿病組(mg/kg，i.g .)。在前4周，每組大鼠僅給予HFD，而正常組僅接受常規(guī)食物。在第5周開始時(shí)，用HFD喂養(yǎng)的大鼠接受STZ (35毫克/千克，腹膜內(nèi))一次或兩次，間隔一周。當(dāng)空腹血糖水平達(dá)到16.7 mM時(shí)，HFD低STZ大鼠被認(rèn)為是糖尿病大鼠。在第9-12周，進(jìn)行了纈沙坦或三劑大精酸的干預(yù)。一組正常大鼠分別用大精酸(200毫克/千克，靜脈注射)處理。正常組和未治療糖尿病組的大鼠給予等體積的0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)。每隔3天監(jiān)測(cè)一次體重增加，并在第4、8和12周末對(duì)各組進(jìn)行比較。
2.4 .生化分析
血清葡萄糖、睪酮和促黃體生成素(LH)水平通過(guò)化學(xué)發(fā)光法測(cè)定，如先前報(bào)道(馮等，2007)。睪丸乳酸脫氫酶(LDH)、酸性磷酸酶、琥珀酸脫氫酶(SDH)和丙二醛(MDA)的活性按南京程健生物工程研究所提供的試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。
2.5組織學(xué)評(píng)估
睪丸組織用10%中性福爾馬林固定，包埋在石蠟中，切成5mm厚的片，用常規(guī)蘇木精-伊紅(H-E)染色處理。病理學(xué)家在對(duì)實(shí)驗(yàn)剖面不了解的情況下，在光學(xué)顯微鏡下對(duì)所有切片進(jìn)行檢查，并在200倍放大倍數(shù)下拍照(馮等人，2007)。
2.6精子和性行為
通過(guò)腹膜內(nèi)注射20%氨基甲酸乙酯來(lái)麻醉雄性大鼠，并且如先前報(bào)道的那樣評(píng)估精子密度和運(yùn)動(dòng)性(馮等人，2007)。
雄性大鼠的性行為按照之前描述的程序進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并做了一些修改(馮等人，2007；Saito等人，2003年；Suresh等人，2009年)。選擇陰道涂片顯示發(fā)情前期特征和連續(xù)重復(fù)4天發(fā)情周期的2個(gè)周期后的雌性大鼠(8周齡)。將雄性大鼠在黑暗中放置10分鐘后，在低水平紅光照明下將一只性接受雌性大鼠引入該室。在夜間20分鐘內(nèi)(21:00至21:20)記錄交配行為。記錄并比較7組動(dòng)物的在體活動(dòng)頻率和射精頻率
2.7 .睪丸間質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)
根據(jù)我們之前的實(shí)踐，分離了成年大鼠的Leydig細(xì)胞(Zhang等人，2013)。簡(jiǎn)而言之，在冰上剝離白膜后，在無(wú)菌條件下從大鼠中取出睪丸，并在37°C下用稀釋于D-Hanks溶液的0.25%膠原酶II消化近18 min。然后加入含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化。以1000 r/min的速度離心消化組織，并用100目篩過(guò)濾。此后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)以確保細(xì)胞密度保持在1 x 105/ml。最后，將細(xì)胞接種在培養(yǎng)容器中。必須每天更換培養(yǎng)基，1周后將細(xì)胞隨機(jī)分為7組:對(duì)照組、與高葡萄糖(25 mM)孵育60 min的細(xì)胞和高葡萄糖組、在過(guò)去30分鐘內(nèi)接受纈沙坦(10-6M)和大精酸(10-5，10-6，10-7M)治療的培養(yǎng)，以及接受大精酸(10-5M)治療的正常培養(yǎng)。PPARα、PPARγ、OBRb、采用RT-PCR和Western Blotting檢測(cè)PERK和IκBβ。羅布麻苷(APO，10-5M)，一種NADPH氧化酶阻斷劑，也被應(yīng)用于高葡萄糖培養(yǎng)基中，以進(jìn)行比較大精酸和纈沙坦。
2.8反轉(zhuǎn)錄PCR
根據(jù)以往的報(bào)告，采用RT-PCR檢測(cè)睪丸中StAR、CHOP、OBRb、IRS-1、IκBβ、MMP2/9、Cx40/43以及Leydig細(xì)胞中StAR、PPARα、PPARγ、OBRb、PERK、IκBβ的mRNA豐度(Li等人，2008)。簡(jiǎn)而言之，根據(jù)制造商的介紹，使用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶將Trizol試劑從睪丸組織和培養(yǎng)細(xì)胞中提取的總RNA反向轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-PCR在25 μl體積中進(jìn)行，cDNA等分試樣為1 μg，產(chǎn)物用溴化乙錠染色，并在紫外燈下檢測(cè)(GDS8000Sygene，劍橋，英國(guó))。使用專業(yè)圖像分析軟件分析每條條帶的光密度，并計(jì)算目標(biāo)基因與GAPDH內(nèi)標(biāo)物的比值。引物的核苷酸序列和PCR擴(kuò)增條件列于表1。
2.9.Western blot分析
為了進(jìn)行定量分析，以體內(nèi)睪丸中的StAR、IRS-1、OBRb、CHOP、IκBβ、MMP2/9和Cx40/43的蛋白水平以及體外高葡萄糖孵育的Leydig細(xì)胞中的StAR、PPARα、PPARγ、OBRb、PERK、IκBβ、p-Akt/Akt (Ser 473)的蛋白水平為靶點(diǎn)。采集一部分睪丸組織(100 mg)和培養(yǎng)的Leydig細(xì)胞，勻漿并在四個(gè)體積的提取緩沖液中提取，然后在4°C下以10，000 x g離心(10 min)。測(cè)定蛋白質(zhì)濃度后，使用前將上清液儲(chǔ)存在-20°C下。
將等分試樣在加載緩沖液中加熱至98°C，并在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)上進(jìn)行分離。轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上并用脫脂牛奶(5%，w/v)封閉后，在4°C下用特異性一抗將印跡培養(yǎng)過(guò)夜。三次洗滌后，將印跡與辣根過(guò)氧化物酶(HRP)-結(jié)合的山羊二抗IgG(f fir fir currency bio retries；1:1000)在室溫下放置1 h，并用DAB試劑盒檢測(cè)。通過(guò)成像采集設(shè)備(Labworks，UK)對(duì)條帶進(jìn)行可視化，并通過(guò)光密度測(cè)定進(jìn)行定量。相對(duì)豐度是通過(guò)對(duì)照β-actin標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)試蛋白的密度獲得的(Zhang等人，2011年)。
圖1。在進(jìn)入實(shí)驗(yàn)時(shí)，與基線相比，以3天的間隔監(jiān)測(cè)體重增加(g)。在第4、8、12周末的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行比較。高脂肪飲食(HFD)在4周結(jié)束時(shí)產(chǎn)生更大的體重增加，并且在第5周開始時(shí)給予單次低劑量的鏈脲佐菌素(STZ，35 mg/kg，i.g .)，消除了在8周結(jié)束時(shí)HFD增加的體重。大精酸(ARL，ARM，ARH: 50，100和200)或纈沙坦(Val: 12)的干預(yù)(mg/kg，i.g .)在過(guò)去4周內(nèi)進(jìn)行，并且不改變體重。平均標(biāo)準(zhǔn)差，n = 10。**P < 0.01，相對(duì)于正常值(NOR)。
表1 用于RT-PCR擴(kuò)增的引物序列和條件
Sequence of primers and conditions used for RT-PCR ampli?cation
2.10統(tǒng)計(jì)分析
所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 11.5(美國(guó))軟件進(jìn)行分析，并以平均值S.D表示。統(tǒng)計(jì)評(píng)估采用單因素方差分析。然后，使用Bonferroni多重比較測(cè)試來(lái)檢查差異的顯著性；在檢查兩個(gè)獨(dú)立樣本的方差時(shí)，使用了獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05的概率值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.結(jié)果
3.1 .體重
通過(guò)測(cè)量體重增加來(lái)監(jiān)測(cè)大鼠，并在各組之間進(jìn)行比較。在4周結(jié)束時(shí)，發(fā)現(xiàn)HFD上的大鼠體重相對(duì)于普通食物上的大鼠有更大的增加。在第5周開始時(shí)，腹腔注射單次低劑量的STZ，然后，體重增加。
在8周結(jié)束時(shí)，體重減輕。在最后4周，加入大精酸或纈沙坦的干預(yù)，在第12周，與未治療或正常大鼠相比，沒有發(fā)現(xiàn)體重增加的進(jìn)一步增加。與正常大鼠相比，施用大精酸的正常大鼠在體重上沒有表現(xiàn)出任何變化(圖1)。
3.2 .血清葡萄糖、睪酮、LH和睪丸LDH、酸性磷酸酶、SDH和MDA
在用HFD和低STZ治療的大鼠中，血清葡萄糖(mmol/l)從11.9±2.4顯著升高至24.7±5.5，P<0.01，并且用大精酸100和200 mg/kg進(jìn)行干預(yù)，即分別顯著降低高血糖水平至20.1±2.4和17.9±3.6，P<0.05和P<0.01。與未治療組相比，纈沙坦還表現(xiàn)出降血糖活性，將血糖水平降低至16.28±3.8 mmol/l，P<0.01。DM組的血清睪酮相對(duì)于正常顯著下降(圖2A)。為了檢測(cè)下丘腦-垂體-睪丸軸(HPT軸)的變化，發(fā)現(xiàn)與正常相比血清LH降低(P<0.01) (圖2B)。
在接受高脂肪飲食和低劑量STZ治療的糖尿病大鼠中，發(fā)現(xiàn)血清中睪酮(A)減少、LH (B)減少，睪丸中LDH (C)、酸性磷酸酶(D)和SDH (E)活性降低，MDA (F)增加，并且通過(guò)分別用大精酸(50、100、200)和纈沙坦(12)治療(mg/kg，即)顯著緩解了這些變化。平均S.D .，n =10。*P<0.05，**P<0.01，與正常組比較；#P <0.05，#P< 0.01，與糖尿病組相比。
血清睪酮水平升高與血清LH恢復(fù)相關(guān)，對(duì)大精酸的反應(yīng)呈劑量依賴性。睪丸LDH、酸性磷酸酶和SDH活性顯著降低。與單用糖尿病大鼠相比，大精酸和纈沙坦顯著消除了這些變化(上圖2C-E)。
糖尿病睪丸病中MDA生成量的升高具有顯著性，并且通過(guò)大精酸或纈沙坦干預(yù)得到緩解。正常雄性大鼠中大精酸藥物治療對(duì)任何參數(shù)均無(wú)影響(上圖)。
3.3 .精子和著床
從糖尿病大鼠附睪尾部采集的精子密度和能動(dòng)性顯著降低(圖2A和B)。對(duì)性行為的評(píng)估是基于觀察雄性大鼠對(duì)夜間見到雌性大鼠的反應(yīng)，與正常大鼠相比，糖尿病雄性大鼠的交配和射精數(shù)量明顯增加和減少。(圖3C和D)通過(guò)大精酸或纈沙坦緩解了精子發(fā)生和性行為方面的缺陷(圖3A-D)。大精酸以劑量依賴性方式減弱這些變化，其有效性與纈沙坦相當(dāng)。例如，以200 mg/kg劑量服用大精酸的正常雄性大鼠對(duì)精子和交配沒有表現(xiàn)出影響。
在高脂肪飲食和低劑量STZ的糖尿病大鼠中，精子和性行為的變化是顯著的，這些變化通過(guò)大精酸(50，100，200)和纈沙坦(12)干預(yù)(mg/ kg，i.g .)得到緩解。(一)、精子計(jì)數(shù)，(二)、精子活動(dòng)率，(三)、著床數(shù)，(四)、射精數(shù)。均S.D .，n=10。*P<0.05。**Po0.05，#P<0.01，與糖尿病相比；$P <0.05，$ P<0.01，與AR50相比。
3.4.StAR、IRS-1、OBRb、CHOP和IκBβ體內(nèi)
在接受HFD和低劑量鏈脲佐菌素注射的大鼠中，StAR的mRNA表達(dá)和豐度均較體內(nèi)正常水平降低(P<0.01)，表明糖尿病睪丸中睪酮生物合成活性較正常水平降低(圖4A和B)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)StAR蛋白下降是否與IRS-1的變化有關(guān)。與正常睪丸相比，糖尿病睪丸中IRS-1下調(diào)顯著，P < 0.01(圖4C和D)。瘦素受體，相對(duì)于正常睪丸，OBRb在糖尿病睪丸中顯著上調(diào)(P <0.01)(圖4E和F)。與正常睪丸相比，ER應(yīng)激傳感器CHOP的增加在糖尿病睪丸病的病理學(xué)中有明顯的隱含意義(P<0.01)(圖4G和H)。相對(duì)于正常水平，IκBβ的上調(diào)在2型糖尿病睪丸病中顯著(圖4I和J)。使用大精酸干預(yù)后，這些異常明顯變鈍。對(duì)纈沙坦的反應(yīng)也為陽(yáng)性，然而，在正常大鼠中對(duì)大精酸治療無(wú)反應(yīng)(圖4)。
在高脂肪飲食和低劑量STZ治療的糖尿病大鼠的睪丸中，StAR、OBRb、IRS-1、CHOP和IκBβ水平出現(xiàn)顯著異常。與對(duì)照組相比，在糖尿病睪丸病中，StAR ((A)、(B))和IRS-1 ((C)、(D))的表達(dá)減少，與OBRb ((E)、(F))、CHOP ((G)、(H))和IκBβ（I）、(J) 的表達(dá)增加相關(guān)，這是顯著的。這些變化分別通過(guò)大精酸(50、100、200 mg/kg，i.g .)或纈沙坦(12 mg/kg，i.g .)緩解。平均S.D .，n= 10。*P<0.05，**P<0.01，與正常(NOR)比較；#P< 0.05，#P<0.01，與糖尿病(DM)比較。
3.5 . MMP 2/9和Cx40/43
在糖尿病睪丸病中，MMP2/9的基因表達(dá)和蛋白豐度顯著上調(diào)(圖5A-D)。同時(shí)聚焦生殖細(xì)胞間通過(guò)連接蛋白縫隙連接的信號(hào)傳遞，Cx40/43的表達(dá)和蛋白較正常明顯下調(diào)(P<0.01)(圖5E-H)。與未治療的患病睪丸相比，在過(guò)去4周內(nèi)使用大精酸或纈沙坦治療顯著減弱了異常(P<0.01)。
在糖尿病大鼠睪丸中，MMP2 ((A)、(B))、MMP9 ((C)、(D))、Cx40 ((E)、(F))和Cx43 ((G)、(H))的mRNA表達(dá)和western blot有明顯改變。通過(guò)體內(nèi)大精酸或纈沙坦干預(yù)，這些變化顯著減弱。平均S.D .，n= 10。*P< 0.05，**P< 0.01，與正常(NOR)比較；#P< 0.05，##P< 0.01，與糖尿病(DM)比較。
3.6. 體外StAR、PPARα、PPARγ、OBRb、PERK、IκBβ參數(shù)
在體外培養(yǎng)的Leydig細(xì)胞(從正常雄性大鼠中急性分離)中測(cè)量了StAR、PPARα、PPARγ、OBRb、PERK、IκBβ和p-Akt/Akt的mRNA和蛋白表達(dá)。與正常組相比，在高葡萄糖培養(yǎng)60 min時(shí)，StAR顯著下調(diào)(P o0.01)，與下調(diào)的PPARα和PPARγ相關(guān)(P<0.01)(圖6A-F)。同時(shí)，相對(duì)于正常，OBRb、PERK和IκBβ顯著上調(diào)，P o0.01(圖6G-L)。大精酸和纈沙坦能顯著緩解這些變化。然而，在正常葡萄糖培養(yǎng)基中的Leydig細(xì)胞中未發(fā)現(xiàn)對(duì)大精酸的應(yīng)答。相對(duì)于正常水平，發(fā)現(xiàn)p-Akt/Akt上調(diào)(P<0.01)，并分別被大精酸、纈沙坦或NADPH氧化酶阻斷劑APO減弱(圖6M)。
圖6。在高葡萄糖培養(yǎng)基培養(yǎng)60 min的體外睪丸間質(zhì)細(xì)胞（Leydig cells）中，發(fā)現(xiàn)StAR ((A)、(B))、PPARα ((C)、(D))、PPARγ ((E)、(F))、OBRb ((G)、(H))、PERK ((I)、(J))和IκBβ ((K)、(L))的RT-PCR和蛋白分布發(fā)生顯著改變。這些變化通過(guò)大精酸(10-7，10-6，10-5M)或纈沙坦(10-6M)得到緩解。(M) 在高葡萄糖培養(yǎng)的Leydig細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)p-Akt/Akt上調(diào)，分別被大精酸(10-5M)、纈沙坦(10-6M)和APO(羅布麻苷10-5M, NADPH氧化酶阻斷劑)抑制。平均S.D .，n = 5-6。*P< 0.05，**P< 0.01，與正常(NOR)比較；#P< 0.05，#P<0.01，與高糖(HG)比較。(A) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的StAR，(B) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的StAR 細(xì)胞，(C) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PPARα，(D) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PPARα，(E) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PPARγ，(F) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PPARγ，(G) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的OBRb，(H) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的OBRb，(I) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PERK，(J) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的PERK，(K) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的IκBβ，(L) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的Iκ-Bβ和(M) 睪丸間質(zhì)細(xì)胞中的p-Akt/Akt。
3.7 .組織變化
以正常大鼠為對(duì)照，觀察了HFD和低劑量STZ對(duì)雄性大鼠睪丸的組織學(xué)影響。在H–E染色的正常睪丸中，多層上皮細(xì)胞排列整齊，密集在曲細(xì)精管中，生殖上皮與曲細(xì)精管基底緊密相連。精子在小管腔內(nèi)豐富，間質(zhì)細(xì)胞高密度地存在于小管之間的間隙中。在糖尿病睪丸中，扭曲的結(jié)構(gòu)明顯顯示生殖生殖細(xì)胞層扭曲和減少，精子缺失，在管腔中心呈現(xiàn)大空間。多層上皮細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的骨架被嚴(yán)重?cái)_亂，在生殖 糖尿病睪丸生精小管的細(xì)胞和基底。小管之間的間質(zhì)細(xì)胞密度大大減少。這些變化代表了糖尿病睪丸中雄激素和精子活性較低的圖片，并且分別通過(guò)大精酸和纈沙坦的干預(yù)而顯著減弱(圖7）
高脂飲食和低劑量STZ注射12周后，糖尿病大鼠睪丸的H–E染色形態(tài)學(xué)發(fā)生了顯著變化。在最后4周(200倍)中，通過(guò)在大鼠中用3個(gè)劑量(50、100和200)的大精酸或纈沙坦(Val，12)治療(mg/kg，i.g .)來(lái)緩解這些變化。(A)正常；(B)糖尿?。?C)糖尿病+Val；(D) 糖尿病+大精酸50；(E) 糖尿病+大精酸100；(F) 糖尿病+大精酸200；和(G) 正常+大精酸200。
4.討論
本研究中，接受HFD和低劑量STZ治療的大鼠表現(xiàn)出睪丸功能障礙，其特征為血清睪酮和LH水平低、性行為減少、組織學(xué)結(jié)構(gòu)異常，與StAR下調(diào)相關(guān)。IκBβ和ER應(yīng)激伴侶的上調(diào)在對(duì)高血糖/高糖培養(yǎng)基的反應(yīng)中具有重要意義。異常的線粒體和NADPH氧化酶是活性氧的主要來(lái)源，有助于改變內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞核之間的互動(dòng)；活性氧生成和NADPH氧化酶激活由AT-1受體介導(dǎo)(Cabello-Verrugio等人，2011)；因此，使性功能障礙效應(yīng)減弱，這與Silva等人(2009年)的研究結(jié)果一致。
響應(yīng)于低血清睪酮，代謝綜合征中的男性性腺功能減退以性腺功能減退為特征(Dandona等人，2008；Mah和Wittert，2010)，F(xiàn)SH和LH水平較低，這可能是由于糖尿病引起下丘腦-垂體神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)病變所致。
LDH、酸性磷酸酶和SDH活性的下降可能表明，通過(guò)減少來(lái)自共同承諾的TCA(三羧基酸循環(huán))的能量產(chǎn)生，睪酮的生物合成和精子發(fā)生受損。SDH活性降低與線粒體功能障礙有關(guān)(Aly等人，2012年)。
在睪酮生物合成中，StAR被認(rèn)為是限制性步驟，并且在睪丸功能障礙中總是發(fā)現(xiàn)減少的StAR(羅等人，2011；Wang等，2010)和我們之前的報(bào)告(馮等，2007；張等，2013)和正可能由ER應(yīng)激介導(dǎo)(Liu等，2012)。
肥胖患者中常發(fā)現(xiàn)男性性腺功能減退(Pauli等人，2008年)。脂肪組織的增加會(huì)分泌更多的瘦素來(lái)激活OBRb (Han等人，2010年)，并對(duì)生精小管中的生精細(xì)胞和管間間隙中的Leydig細(xì)胞產(chǎn)生不利影響。氧化應(yīng)激是由于瘦素及其受體刺激交感神經(jīng)系統(tǒng)而產(chǎn)生的(Tentolouris等人，2006；康斯坦蒂尼蒂斯等人，2009年)。因此，OBRb的激活提供了一種以氧化劑增加和IRS-1減少為特征的炎癥實(shí)體(康斯坦蒂尼蒂斯等人，2009；Pilon等人，2010年)。
前4周期間，僅在HFD進(jìn)食的大鼠的體重增加幅度大于在普通食物中進(jìn)食的大鼠。低劑量STZ的毒性可消除體重增加。在HFD聯(lián)合STZ的大鼠中，激活的OBRb在12周結(jié)束時(shí)是顯著的。HFD大鼠可能顯著影響瘦素水平，但不影響OBRb水平(Staszkiewicz等人，2007年)。
在本研究中，OBRb升高可能是由以下因素引起的高血糖綜合作用的結(jié)果低STZ。事實(shí)上，僅高葡萄糖培養(yǎng)基就足以上調(diào)Leydig細(xì)胞中的OBRb蛋白。HFD的肥胖可能會(huì)影響精子質(zhì)量(Fernandez等人，2011年)，并影響小鼠的精子發(fā)生和潛在的保護(hù)作用(Palmer等人，2011年)。精子數(shù)量和能動(dòng)性的顯著變化以及性行為的顯著減少是由HFD病和高血糖癥的共同作用引起的。
通過(guò)上調(diào)OBRb，和low引發(fā)大鼠睪丸功能受損和勃起功能障礙(Zhang等人，2006年)；并且亞臨床的炎癥會(huì)被包括NFκB在內(nèi)的幾種促炎因子的增加所加速(Tong等人，2008；Ben-Neriah和Karin，2011年)。在體內(nèi)糖尿病睪丸和體外高糖處理的Leydig細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)上調(diào)的IκBβ，這使得進(jìn)入細(xì)胞核的NFκB增加，從而導(dǎo)致炎癥狀態(tài)。OBRb的上調(diào)已經(jīng)成為緩解生殖道功能障礙的目標(biāo)(Polkowska等人，2006年)。糖尿病大鼠LH分泌減少的逆轉(zhuǎn)可能源于抑制下丘腦-垂體神經(jīng)連接中上調(diào)的OBRb。
IRS-1在睪丸中高度表達(dá)，特別是在支持細(xì)胞、精母細(xì)胞和腎小管周肌樣細(xì)胞中，因此，由IRS-1介導(dǎo)的胰島素信號(hào)通路在多細(xì)胞部位調(diào)節(jié)睪丸功能(Kokk等人，2007)。IRS-1中Ser/Thr磷酸化的改變與胰島素抵抗有關(guān)(Lu等人，2009年)。氧化劑和炎癥介質(zhì)導(dǎo)致IRS-1途徑失效(Archuleta等人，2009；Dali- Youcef等人，2012年)。通過(guò)p-Akt (Ser473)/Akt比值的增加激活A(yù)kt途徑，表明在高葡萄糖培養(yǎng)基的Leydig細(xì)胞中存在炎癥特征(叢等人，2012a)，并伴有IκBβ上調(diào)，表明Leydig細(xì)胞中存在炎癥特征。
PPAR家族PPARα和PPARγ的兩種亞型在睪丸功能障礙中顯著下調(diào)。PPARα激活可通過(guò)抑制脂肪毒性、炎癥反應(yīng)和活性氧生成來(lái)減弱糖尿病血管病變(Hiukka等人，2010年)，已成為預(yù)防糖尿病睪丸病的新靶點(diǎn)。PPARα激動(dòng)劑通過(guò)提高testoster- one合成基因StAR和P450scc的表達(dá)，有效緩解血清睪酮水平下降(Li等人，2011年)。PPARγ調(diào)節(jié)支持細(xì)胞脂質(zhì)代謝基因的表達(dá)且在精子發(fā)生中起主要作用(Thomas等，2011)。吡格列酮是一種PPARγ配體，具有抗氧化特性，可顯著改善二型糖尿病患者的精子異常(Rabbani等人，2010)。PPARγ上調(diào)可緩解糖尿病患者的胰島素抵抗和β細(xì)胞功能障礙(Sharma等人，2011年)。PPARα和PPARγ的下調(diào)與組織中的炎癥反應(yīng)有關(guān)(Abcouwer，2013；Hwang等人，2012年)。
MMP2/9是調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)數(shù)量的關(guān)鍵酶，受ET受體調(diào)節(jié)(Peng等人，2010)。ET-1是NADPH氧化酶的刺激劑，NADPH氧化酶的激活會(huì)引起睪丸中的氧化應(yīng)激。在糖尿病中，功能障礙睪丸存在MMP2/9異常，這影響精子發(fā)生和雄激素生物合成，與糖尿病和缺氧引起的功能障礙睪丸的結(jié)果一致(Zhang等人，2013，，2009)。細(xì)胞間間隙連接通訊通過(guò)ECM經(jīng)Cx40/43傳導(dǎo)。Cx40/43表達(dá)下降是導(dǎo)致睪丸衰竭的重要事件，Cx40/43表達(dá)上調(diào)為異常生殖系統(tǒng)的恢復(fù)提供了基礎(chǔ)。Cx43作為一種調(diào)節(jié)劑，對(duì)支持細(xì)胞和生殖細(xì)胞維持精子發(fā)生和血睪丸屏障的功能至關(guān)重要(Weider等人，2011；Li等人，2010)，并且是診斷和治療睪丸疾病的靶點(diǎn)(Chevallier等人，2012)。
5.結(jié)論
HFD病和低STZ病引起的糖尿病睪丸病功能障礙的特征是STAR表達(dá)低，血清睪酮和LH水平低。2型糖尿病睪丸病中存在低度炎癥實(shí)體，這與二型糖尿病病是炎癥問(wèn)題的事實(shí)一致(Calle和Fernandez，2012)。在ER應(yīng)激伴侶上調(diào)的糖尿病睪丸病表現(xiàn)中，IκBβ、p-Akt、OBRb和MMP2/9與下調(diào)的IRS-1、PPARα/γ和Cx40/43顯著相關(guān)。與這些促炎因素相關(guān)的睪丸功能低下也可能表明心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素增加(Hyde等人，2012年)。
盡管對(duì)二型糖尿病及其睪丸病的含義已達(dá)成共識(shí)，但該問(wèn)題的處理仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的問(wèn)題(Calle和Fernandez，2012)。這些變化分別通過(guò)抗炎癥和抗氧化活性對(duì)大精酸和纈沙坦有很好的反應(yīng)。大黃酸雙醋瑞因的另一種衍生物在HFD小鼠中提供了糾正胰島素敏感性和抑制促炎細(xì)胞因子和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的益處(Tobar等人，2011)。將L-精氨酸結(jié)合到大黃酸部分的大精酸可能更有意義，因?yàn)樗茌斔蚇O(一氧化氮)供體并具有抗炎癥活性，還能延長(zhǎng)t1/2(叢等人，2012a，2012b)，這有利于糖尿病睪丸病的治療。
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