前言：行業(yè)內(nèi)公認，X-射線衍射圖譜（XRD）是確定多晶型最可靠的依據(jù)，XRD圖譜也常被稱為晶型的“指紋”。由于有機藥物晶體峰位多且雜，重疊嚴重，嚴格意義上的單純圖譜比較，往往得出生產(chǎn)藥品晶型與標準品完全不同的結(jié)論，這種圖譜對比差異在原料藥申報及研究生產(chǎn)過程中帶來諸多困擾。因此需要根據(jù)研究目的，有策略的系統(tǒng)分析XRD圖譜數(shù)據(jù)。
XRD圖譜分析中的主要問題
1、粉末衍射XRD圖譜與標準圖譜比對
涉及到晶型的原料藥申報和研究生產(chǎn)中，均需要與標準品或者理論圖譜比較，粉末X-射線衍射儀測試后處理得到的XRD數(shù)據(jù)分為以下三類：（標準圖譜的獲取方式詳見20201215期推文：《被忽略的“XRD標準譜”的獲取技巧》）。
（1）2θ角度和晶面間距（d值）確定多晶型類型，是藥物API中原子和分子的排列方式及位置信息；是晶型的特征信息。
（2）峰高度（Hight）、峰強度（Int.I）、相對峰強度（Rel.int.）是晶型中不同晶面分布的統(tǒng)計，是樣品晶型的特征信息，也是晶型定量分析的基礎(chǔ)。
（3）半峰寬（FWHM）表征衍射峰的峰形，反映多晶體晶粒尺寸、外形、尺寸分布等性質(zhì)，不作為晶型的特征信息。
藥物晶型研究中，最常用的是通過2θ（或d-spacing）與相對峰強度Rel.Int比較晶型的一致性。但由于峰強度受樣品制備、測試條件、儀器等影響較大，對于原料藥申報等重要圖譜比對和晶型定量分析中，則需要單獨開發(fā)樣品制備、測試等方法，保證樣品峰位置和峰強度的可重現(xiàn)性。對于需要兼顧效率的批次圖譜的對比：如專利晶型確定、晶型篩選等，大家公認：（1）粉末XRD圖譜的峰位置（或者晶面間距d值）有時比強度更重要；（2）藥物晶體中低角度的數(shù)據(jù)比高角度數(shù)據(jù)更重要；(3)有機藥物晶體在40°以上基本無鑒別意義的衍射峰（晶面間的距離越大，角度越小，晶面上的原子排列越密集）。
2、峰缺失和衍射峰強度次序變化
晶型相關(guān)研究及實踐過程中，經(jīng)常會遇到PXRD圖譜少量峰缺失，峰強度不一致的情形，對于遇到這類問題，常結(jié)合熱分析DSC/TGA、固體紅外、拉曼等輔助數(shù)據(jù)判斷其是否為新晶型，同一晶型出現(xiàn)峰的缺失和衍射峰強度次序變化有以下幾種可能原因：
(1)“晶體粒度”的影響
利福平晶型II樣品，依次經(jīng)過30、60、120、200目的篩子后測試粉末衍射圖譜，發(fā)現(xiàn)同一樣品，過篩為不同粒度級別的樣品進行測試，得到的XRD圖譜峰強度及強度次序發(fā)生明顯變化，并且局部放大圖顯示，過30目篩子(0.6mm)的譜圖,存在明顯的“峰缺失”(圖2框線標注部分)，如下圖1/2所示：
圖1利福平同一樣品過不同篩目后，XRD圖譜峰強度差異巨大
圖2利福平同一樣品過不同篩目后，XRD圖譜局部放大圖顯示部分峰的缺失示意圖
晶型粒度對“峰缺失”和峰強度影響原因：衍射強度本質(zhì)是對不同晶面分布的統(tǒng)計。因此XRD測試中，理論上1cm2的面積上要有超過1100萬個衍射數(shù)據(jù)才具有統(tǒng)計的意義。我們常用的X-射線粉末衍射儀，測試的樣品對象是“一堆多晶粉末”，且其中的每一粒粉末都是“多晶體”。“多晶體”是由多個小晶體組成的晶體結(jié)構(gòu)。每個小晶體（即單晶）的內(nèi)部，晶格位向是均勻一致的，而各個小晶體之間，彼此的位向卻不相同。粒度較大的“多晶”樣品，內(nèi)部小晶體間的各項異性導致不同粒度產(chǎn)品峰強度差異顯著，甚至出現(xiàn)少量峰缺失（即大家熟知的“擇優(yōu)取向”）。因此X-射線粉末衍射樣品制備中，樣品需要經(jīng)過研磨處理，一般情況下，樣品手感像面粉，有滑膩的感即可。而對于晶型含量的定性研究中，研磨樣品需要過360目篩的粉末顆粒用于分析。
(2)制樣過程“研磨”的影響
如前所述，通常對樣品進行研磨降低大粒度樣品“擇優(yōu)取向”的影響。但“研磨”有導致晶型轉(zhuǎn)變（壓力轉(zhuǎn)晶）和結(jié)晶度降低的風險，從而導致不同程度的“峰缺失”或“峰強度”改變。如某一致性評價藥品晶體，研磨2min、3min、4min的樣品與研磨1min的樣品對比，19.4°處（特征強峰）的峰缺失。又如圖4布洛芬晶體，研磨前后，峰強度差異明顯。
圖3某一藥物晶體不同研磨時間的XRD放大圖譜
圖4布洛芬研磨前后以及單晶模擬的XRD圖及差異圖表
（3）晶體形貌的影響
對于“薄片狀”和“細長針狀”形貌的晶體，特點是長徑比非常大。采用壓片法制樣，幾乎無法消除擇優(yōu)取向的影響。測試得到的圖譜特定晶面峰缺失嚴重，峰強度重復性差。特殊裝樣方法：如撒樣或側(cè)法裝樣，是這類特殊晶體形貌樣品得到可重復圖譜的關(guān)鍵。
（4）樣品試片平面的影響
試片表面形狀不規(guī)則、毛糙、向上或向下凹凸等，會引起XRD衍射圖譜峰的寬化、峰位置的位移、衍射峰強度重現(xiàn)性差。制樣過程中，要求輕輕壓片磨平。
此外，粉末XRD的峰位置、相對峰強度受洛倫茲極化、吸收、溫度等的影響，衍射儀法的衍射峰相對強度公式如下：
在對晶型XRD強度允許的誤差范圍是5%；峰位置的偏差限度為±0.2°。因此對于定量分析及重要批次的圖譜重復性，在設(shè)備、制樣等一致情況下，滿足上述2θ±0.2°，峰強度5%限度要求。
3、峰形:半高寬、峰對稱性
完美晶體（理想晶體）的衍射峰形為一條直線，而實際晶體衍射峰有一定的寬度；在衍射強度一半的高度對應的一個峰形的半寬高（B），如下圖5所示。
圖5 （a）實際晶體的衍射峰形；（b）理想晶體的衍射峰形
衍射峰的峰寬受三個因素的影響：儀器本身造成的固有寬度、晶格畸變引起的寬化和晶粒尺寸影響。這三部分對衍射峰峰形的影響并不是簡單的累加作用，而是一種“卷積”關(guān)系。晶體XRD圖譜的峰形不作為晶型的特征信息。
4、結(jié)晶度與無定形混晶的區(qū)分
結(jié)晶度的概念來源于材料領(lǐng)域，是用來表示聚合物中結(jié)晶區(qū)域所占的比例。圖7藥物晶體領(lǐng)域結(jié)晶度的示意圖，藥物晶型結(jié)晶度類似表示晶體結(jié)晶區(qū)域的比例。即分子層面晶體的排列方式是一致的（晶型一致，因為晶型的定義即是分子的排列方式），但排列“緊密程度”存在區(qū)別，導致晶型結(jié)晶度的不一致。
圖6 藥物晶型結(jié)晶度示意圖
圖7 標示“mixed system”的XRD圖譜，可能是混有一定量的無定形，但也可能
是同一種晶型，只是結(jié)晶工藝的差異，得到的同一種晶型結(jié)晶度有差異。
圖7 結(jié)晶度or無定形混晶的XRD示意圖
5、2θ角度與晶面間距d相互轉(zhuǎn)換
晶型相關(guān)專利及文獻中，經(jīng)常會隨機的只給出2θ角度值或者晶面間距d值，類似情況經(jīng)常需要我們通過布拉格公式進行換算。2θ角度和晶面間距滿足拉格定律：2dsinθ=n*λ（d為平行原子平面的間距，λ為入射波波長，θ為入射光與晶面之夾角，n為衍射級數(shù)），即二者之間數(shù)據(jù)可以互換計算。X射線入射波長是通過濾波鏡的單色光（特定波長）即λ為定值：藥物晶體最常使用的cu靶X射線波長為1.5406；n為衍射級數(shù)，XRD衍射中，級數(shù)為1；根據(jù)布拉格定理，相互換算計算方式如圖所示：
圖8 2θ角度與晶面間距d相互轉(zhuǎn)換晶的計算方法
小結(jié)：藥物晶體X-射線衍射技術(shù)主要包括單晶X-射線衍射技術(shù)和粉末X射線衍射技術(shù)。單晶X射線衍射技術(shù)本身可以單獨完成結(jié)構(gòu)、組分、含量、構(gòu)型晶型等各類分析，它技術(shù)難度在于獲取可解析的單晶。而粉末X射線衍射圖譜，主要用于多晶形態(tài)的識別，測試結(jié)果影響因素較大，技術(shù)難點在于有策略的、系統(tǒng)的分析圖譜。
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