摘要 目的：討論環(huán)境分離菌在藥品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用。方法：通過(guò)對(duì)各國(guó)藥典、法規(guī)、指導(dǎo)原則、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)指南等文件的梳理和分析，列出了環(huán)境分離菌在藥品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用建議和要求，并結(jié)合實(shí)例，進(jìn)一步介紹了環(huán)境分離菌的應(yīng)用范圍。結(jié)果：各國(guó)藥典和行業(yè)指南均要求或建議在消毒劑效能驗(yàn)證、抑菌效力檢查、培養(yǎng)基方法適用性（培養(yǎng)基促生長(zhǎng)試驗(yàn)）、檢驗(yàn)方法的適用性、快速微生物檢驗(yàn)方法和微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證等檢驗(yàn)項(xiàng)目中增加使用環(huán)境分離菌（包括生產(chǎn)檢驗(yàn)過(guò)程中人員、環(huán)境以及樣品中分離菌）。結(jié)論：與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，環(huán)境分離菌更能夠反映樣品或環(huán)境實(shí)際存在微生物的情況，因此，在藥品微生物檢驗(yàn)中應(yīng)用環(huán)境分離菌能夠使檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量或環(huán)境做出更客觀和科學(xué)的評(píng)價(jià)。可根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目、藥品的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品本身的特點(diǎn)，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境分離菌應(yīng)用于檢驗(yàn)過(guò)程中。
藥品微生物的檢驗(yàn)結(jié)果受多種因素影響，因此，在藥品微生物檢驗(yàn)中，為保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性，必須使用經(jīng)驗(yàn)證的檢測(cè)方法并嚴(yán)格按照藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則要求進(jìn)行檢驗(yàn)[1]。一方面，在對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行驗(yàn)證或確認(rèn)時(shí)，需要使用菌株來(lái)進(jìn)行相應(yīng)的判斷。例如，藥品的無(wú)菌檢查、微生物限度檢查、原輔料的生物負(fù)載檢測(cè)等試驗(yàn)過(guò)程的方法適用性、培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)均需要使用菌株。具體步驟大致為：制備菌液后接種至供試液或培養(yǎng)基，根據(jù)生長(zhǎng)情況來(lái)對(duì)方法進(jìn)行確認(rèn)，一些定量方法要求回收率達(dá)到50%~200%，一些定性方法要求判斷生長(zhǎng)情況，一些培養(yǎng)基適用性中需要判斷微生物在培養(yǎng)基上的菌落大小、形態(tài)特征、指示劑反應(yīng)等情況[1]。另外一方面，部分檢驗(yàn)方法的目的是測(cè)定高負(fù)載微生物下降的水平，評(píng)價(jià)對(duì)微生物的抑制或殺滅作用，例如抑菌效力檢查、消毒劑消毒效能驗(yàn)證等，這些檢驗(yàn)項(xiàng)目亦需要使用菌株[1-2]。
包括《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）在內(nèi)的各國(guó)藥典中，一般都規(guī)定使用標(biāo)準(zhǔn)菌種進(jìn)行上述試驗(yàn)[1-4]。雖然這些標(biāo)準(zhǔn)菌株的應(yīng)用可以使各個(gè)實(shí)驗(yàn)室的結(jié)果在一定程度上具有可比性并且便于在實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行方法轉(zhuǎn)移確認(rèn)，但是又存在另一問(wèn)題，就是標(biāo)準(zhǔn)菌株無(wú)法代表環(huán)境和樣品中實(shí)際污染的微生物。因此，各國(guó)藥典指導(dǎo)原則和行業(yè)指南中均提出在進(jìn)行藥品微生物檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)增加環(huán)境分離菌的使用，從而使檢驗(yàn)方法的針對(duì)性更強(qiáng)。
從本質(zhì)上來(lái)講，檢驗(yàn)的目的是希望能夠檢出樣品或環(huán)境中可能存在的微生物，盡可能反映樣品或環(huán)境污染微生物的真實(shí)情況，從而為產(chǎn)品質(zhì)量或環(huán)境的評(píng)估做出客觀科學(xué)的評(píng)價(jià)。“未檢出”中的假陰性結(jié)果可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)際存在污染微生物甚至超標(biāo)的產(chǎn)品放行到市場(chǎng)上威脅人們的健康，也會(huì)導(dǎo)致不良的生產(chǎn)或檢驗(yàn)環(huán)境未被發(fā)現(xiàn)，從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量控制。因此，環(huán)境分離菌在藥品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用會(huì)在一定程度上避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，使檢驗(yàn)結(jié)果更具針對(duì)性，更能反映真實(shí)情況。本文就環(huán)境分離菌在不同檢驗(yàn)項(xiàng)目、檢驗(yàn)過(guò)程中不同環(huán)節(jié)中的應(yīng)用進(jìn)行討論和分析，并給出環(huán)境分離菌選擇和使用的建議，希望能夠引起相關(guān)從業(yè)者對(duì)藥品研發(fā)、質(zhì)量控制和監(jiān)管的思考，在日常工作中酌情考慮環(huán)境分離菌的應(yīng)用，進(jìn)一步保障藥品微生物的檢驗(yàn)方法更具針對(duì)性，使檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。
一、消毒劑效能驗(yàn)證
消毒劑廣泛應(yīng)用于藥品生產(chǎn)和檢驗(yàn)環(huán)境，其主要目的是作用于環(huán)境，降低環(huán)境的生物負(fù)載量。因其主要作用于環(huán)境中的微生物，各國(guó)藥典、法規(guī)和指南均要求使用環(huán)境分離菌來(lái)進(jìn)行消毒劑效果的確認(rèn)，并且都要求根據(jù)消毒劑類型選擇合適的微生物進(jìn)行考察[5]。
美國(guó)藥典第43版的《1072消毒劑和防腐劑》[2]章節(jié)中明確：因?yàn)楦鞣N菌對(duì)不同消毒劑的耐受性都有實(shí)際差異，因此，在消毒劑管理程序中，應(yīng)定期使用懸液法，將環(huán)境監(jiān)控中最常見(jiàn)的分離微生物用于確認(rèn)其敏感性。為了證明消毒劑對(duì)制藥環(huán)境的效能，應(yīng)進(jìn)行如下試驗(yàn)：（1）使用懸液法（篩查不同濃度消毒劑在不同的接觸時(shí)間條件下對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株和典型環(huán)境分離菌的消毒效能）；（2）載體法（將消毒劑置于載體表面作用于一定濃度標(biāo)準(zhǔn)菌株或環(huán)境分離菌一定的時(shí)間，測(cè)定微生物的lg下降值）；（3）在新的消毒劑使用前后，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)的方法對(duì)比分離微生物的數(shù)量以及種類出現(xiàn)頻率的變化。
日本藥典第17版《消毒劑和除菌方法》[4]章節(jié)包括了消毒劑效果驗(yàn)證，其中載體試驗(yàn)的試驗(yàn)菌的選擇要求為：為了評(píng)估消毒劑效果，除了選擇所列出的標(biāo)準(zhǔn)菌株，應(yīng)選擇1~2株常見(jiàn)的環(huán)境監(jiān)控分離菌。
美國(guó)食品藥品管理局 （FDA）在2004年發(fā)布的《行業(yè)指南-使用無(wú)菌生產(chǎn)工藝生產(chǎn)的無(wú)菌藥品的現(xiàn)行生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（cGMP）》[6]（以下簡(jiǎn)稱FDA2004年無(wú)菌生產(chǎn)工藝指南）在環(huán)境的消毒程序部分也明確要求應(yīng)重視消毒劑對(duì)環(huán)境菌的作用，即日常使用的消毒劑應(yīng)當(dāng)對(duì)從廠房分離的常見(jiàn)微生物有效。必要時(shí)，可以調(diào)查評(píng)估從潔凈區(qū)域中分離的與不良趨勢(shì)相關(guān)的微生物對(duì)該潔凈區(qū)域中所使用的消毒劑的敏感性。
美國(guó)注射劑協(xié)會(huì)（Parenteral Drug Association，PDA）第13號(hào)技術(shù)報(bào)告《環(huán)境監(jiān)控計(jì)劃基礎(chǔ)》[7]在清潔消毒程序中明確要求，應(yīng)使用微生物降低的挑戰(zhàn)試驗(yàn)來(lái)證明消毒程序。推薦使用來(lái)自環(huán)境監(jiān)控程序所分離的常見(jiàn)微生物對(duì)所選的消毒劑進(jìn)行挑戰(zhàn)試驗(yàn)，來(lái)證明消毒劑的實(shí)際有效性。
美國(guó)材料協(xié)會(huì)的《潔凈室消毒劑的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)指南》[8]專門(mén)對(duì)環(huán)境分離菌在消毒劑效果確認(rèn)試驗(yàn)中的使用進(jìn)行了論述，該指南首先指出法規(guī)和監(jiān)管部門(mén)已經(jīng)明確，應(yīng)將環(huán)境分離菌應(yīng)用于消毒劑效果確認(rèn)中，并引用了FDA2004年無(wú)菌生產(chǎn)工藝指南。該指南還指出，沒(méi)有必要包括所有的分離菌，但是有必要在選擇試驗(yàn)菌時(shí)建立有效的基本原則。其基本原則是使消毒劑的消毒效果能夠達(dá)到控制潛在污染微生物風(fēng)險(xiǎn)的目的。
二、 抑菌效力試驗(yàn)
為了防止藥物制劑在正常貯藏或使用過(guò)程中，因微生物的污染和繁殖使藥物變質(zhì)而對(duì)使用者造成危害，如果制劑本身沒(méi)有充分的抗菌效力，應(yīng)根據(jù)制劑特性添加適宜的抑菌劑，尤其是多劑量包裝的制劑。在添加抑菌劑的同時(shí)，應(yīng)考慮到抑菌劑的毒性，保證用藥安全。因此，成品制劑中的抑菌劑有效濃度應(yīng)低于對(duì)人體有害的濃度，從而達(dá)到“最低”“有效”的目的[1]。因此，需要在制劑研發(fā)和穩(wěn)定性試驗(yàn)中進(jìn)行抑菌效力檢查，測(cè)定無(wú)菌及非無(wú)菌制劑的抑菌活性。抑菌效力檢查方法的基本原理都需要在藥物制劑中加入菌液，放置一定時(shí)間后再進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定，根據(jù)菌數(shù)對(duì)數(shù)值的下降來(lái)判斷其抑菌效力。
《中國(guó)藥典》四部通則《1121抑菌效力檢查法》[1]中明確要求，若需要，制劑中常見(jiàn)的污染微生物也可作為試驗(yàn)菌株，例如含高濃度糖的口服制劑還應(yīng)該選用魯氏接合酵母為試驗(yàn)菌株。美國(guó)藥典、歐洲藥典和日本藥典的抑菌效力檢查方法中也有類似的描述。
洋蔥伯克霍爾德菌，并將該菌作為挑戰(zhàn)菌應(yīng)用到不同濃度的苯扎氯銨防腐體系中的抑菌效力評(píng)價(jià)，這表明在特定環(huán)境下的野生菌株對(duì)抑菌劑的耐受性有可能會(huì)高于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)基菌株，在進(jìn)行防腐劑或抑菌劑效力評(píng)價(jià)時(shí)，應(yīng)考慮加入環(huán)境或樣品中的常見(jiàn)分離菌作為挑戰(zhàn)菌[9]。
三、 培養(yǎng)基適用性（促生長(zhǎng)試驗(yàn)）
各國(guó)藥典都要求對(duì)微生物檢驗(yàn)用培養(yǎng)基進(jìn)行適用性試驗(yàn)（或稱為促生長(zhǎng)試驗(yàn)），其目的是確認(rèn)培養(yǎng)基能夠使目標(biāo)微生物生長(zhǎng)，從而保證在檢驗(yàn)時(shí)能夠檢出實(shí)際可能污染的微生物。各國(guó)藥典的檢查法中一般都只要求使用標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行培養(yǎng)基促生長(zhǎng)試驗(yàn)，但是在藥典指導(dǎo)原則和行業(yè)指南中都提出了可以加入環(huán)境分離菌。此處的環(huán)境分離菌可解釋為檢驗(yàn)對(duì)象及環(huán)境可能存在的微生物，例如基于歷史數(shù)據(jù)的環(huán)境菌庫(kù)中的常見(jiàn)菌、樣品常見(jiàn)污染菌等。
美國(guó)FDA于1993年發(fā)布《藥品質(zhì)量控制微生物實(shí)驗(yàn)室檢查指南》[10]，用于指導(dǎo)檢查員對(duì)微生物分析實(shí)驗(yàn)室的檢查。指南中提出，應(yīng)定期用低水平的微生物對(duì)所制備的培養(yǎng)基進(jìn)行挑戰(zhàn)，包括使用美國(guó)藥典規(guī)定的指示微生物以及日常環(huán)境菌。
我國(guó)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局發(fā)布的《無(wú)菌工藝模擬試驗(yàn)指南（無(wú)菌制劑）》[11]、FDA2004年無(wú)菌生產(chǎn)工藝指南[6]、PDA第22號(hào)技術(shù)報(bào)告[12]均要求，在無(wú)菌工藝模擬試驗(yàn)（培養(yǎng)基模擬灌裝）的培養(yǎng)基促生長(zhǎng)試驗(yàn)中，使用藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株的同時(shí)，也應(yīng)考慮使用環(huán)境監(jiān)控和無(wú)菌檢查中分離的污染菌。
美國(guó)藥典43版《1116無(wú)菌生產(chǎn)環(huán)境的微生物控制和監(jiān)控》[2]中提出，在進(jìn)行環(huán)境監(jiān)控用培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)試驗(yàn)時(shí)，所使用的菌株應(yīng)包括環(huán)境監(jiān)控分離菌。
《中國(guó)藥典》2020年版四部通則《9203藥品微生物實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理指導(dǎo)原則》[1]和美國(guó)藥典43版《1117微生物實(shí)驗(yàn)室良好操作規(guī)范》[2]對(duì)培養(yǎng)基具有質(zhì)量控制的要求，在選擇藥典規(guī)定的菌株同時(shí)也可以增加環(huán)境分離菌和產(chǎn)品中常見(jiàn)的污染菌株。
國(guó)際藥品檢查組織（Pharmaceutical InspectionConvention and Pharmaceutical Inspection Cooperation Scheme，PIC/S）2011年發(fā)布的《無(wú)菌工藝驗(yàn)證的建議》[13]對(duì)培養(yǎng)基的要求中提出，選擇的培養(yǎng)基應(yīng)能夠支持廣泛的微生物生長(zhǎng)，這些微生物可能會(huì)存在于生產(chǎn)環(huán)境中，應(yīng)基于企業(yè)的環(huán)境菌庫(kù)（例如來(lái)自環(huán)境監(jiān)控的微生物）來(lái)選擇。
本研究團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)在胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（Trypticase Soy Agar，TSA）的質(zhì)控過(guò)程中使用人參土芽孢桿菌[14]。在日常微生物檢測(cè)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同廠家的TSA對(duì)某藥用輔料污染微生物的檢出能力經(jīng)常出現(xiàn)較大的差異，通過(guò)對(duì)污染微生物進(jìn)行分離和鑒定，確定該微生物為人參土芽孢桿菌。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該菌的生長(zhǎng)受TSA的影響顯著。與藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，該菌具有更好的篩分能力，在培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)中增加使用人參土芽孢桿菌，可以提高現(xiàn)行培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。
四、 檢驗(yàn)方法的適用性
目前，各國(guó)藥典在微生物檢驗(yàn)的方法適用性中均未要求使用環(huán)境或樣品分離菌。但是，樣品本身的污染菌在檢驗(yàn)條件下能否生長(zhǎng)受到多種因素影響，本研究團(tuán)隊(duì)曾經(jīng)研究屎腸球菌對(duì)復(fù)方胰酶散微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)中試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的影響，結(jié)果表明，使用傾注法時(shí)試驗(yàn)細(xì)菌的回收率偏低，其原因是樣品本身所含屎腸球菌的生長(zhǎng)導(dǎo)致瓊脂培養(yǎng)基pH值下降，從而抑制了加入的試驗(yàn)細(xì)菌的生長(zhǎng)[15]。本研究團(tuán)隊(duì)在某中藥顆粒劑的微生物限度檢驗(yàn)時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用平皿法（1mL·皿-1）按照《中國(guó)藥典》規(guī)定的幾株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行方法適用性均能夠達(dá)到對(duì)回收率（50%~200%）的要求，但是樣品污染菌的檢出情況各稀釋級(jí)間不能達(dá)到10倍數(shù)量關(guān)系，懷疑該方法不能有效檢出污染菌，進(jìn)一步使用薄膜過(guò)濾法（1mL·膜-1，100mL·次-1，沖洗2次）才能使檢驗(yàn)結(jié)果更能反映樣品的污染情況。最終選擇使用薄膜過(guò)濾法對(duì)該中藥顆粒劑進(jìn)行微生物限度檢查。因此，在檢驗(yàn)方法的適用性試驗(yàn)和方法轉(zhuǎn)移確認(rèn)時(shí)，應(yīng)注意檢驗(yàn)方法對(duì)實(shí)際污染微生物的檢出能力和回收率。
在檢驗(yàn)方法的適用性試驗(yàn)方面，可以根據(jù)樣品本身特點(diǎn)和容易污染菌的種類，考慮增加環(huán)境分離菌作為方法適用性研究的試驗(yàn)菌。例如某重組生物制品原液，企業(yè)在原液生物負(fù)載檢驗(yàn)方法的適用性試驗(yàn)中，除了使用藥典規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)菌株外，還增加了環(huán)境菌株，包括表皮葡萄球菌（人員分離菌），皮氏羅爾斯通氏菌（水系統(tǒng)分離菌）和蘇云金芽孢桿菌（環(huán)境分離菌），這樣建立的方法更有利于實(shí)際污染菌的檢出。
五、快速微生物檢驗(yàn)方法和微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證
FDA2008年發(fā)布的《細(xì)胞和基因治療產(chǎn)品基于快速微生物方法的無(wú)菌檢查方法驗(yàn)證指南》[16]中對(duì)快速微生物檢驗(yàn)方法（Rapid MicrobiologicalMethod，RMM）驗(yàn)證用菌株進(jìn)行明確要求：應(yīng)根據(jù)RMM在產(chǎn)品和工藝中的性能表現(xiàn)建立一組微生物，應(yīng)包括革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、需氧菌、厭氧菌、酵母、霉菌、原輔料分離微生物、中間產(chǎn)品分離微生物、環(huán)境監(jiān)控分離微生物、生產(chǎn)區(qū)域分離代表低營(yíng)養(yǎng)高應(yīng)激環(huán)境的微生物、生長(zhǎng)緩慢微生物（例如痤瘡丙酸桿菌）、對(duì)于RMM需要復(fù)雜營(yíng)養(yǎng)的微生物和文獻(xiàn)報(bào)道特定產(chǎn)品類型中常見(jiàn)分離菌等。
PDA技術(shù)報(bào)告第33號(hào)《新的微生物檢驗(yàn)方法的評(píng)估、驗(yàn)證和實(shí)施》[17]提到，應(yīng)根據(jù)每一種驗(yàn)證參數(shù)的評(píng)估選擇有代表性的菌株進(jìn)行試驗(yàn)。用戶應(yīng)考慮使用應(yīng)激狀態(tài)的微生物。應(yīng)激狀態(tài)的微生物可以根據(jù)實(shí)際情況，將菌株的培養(yǎng)物暴露于一定環(huán)境條件（例如紫外線、熱、冷、高滲等條件）、抑菌作用（消毒劑、藥物作用）或亞致死滅菌條件下得到。在專屬性試驗(yàn)中應(yīng)使用實(shí)驗(yàn)室的標(biāo)準(zhǔn)菌株以及環(huán)境分離菌株，中間產(chǎn)品和無(wú)菌檢查陽(yáng)性分離菌株，以及生長(zhǎng)緩慢、苛養(yǎng)、厭氧和臨床分離菌株。在將替代方法或快速微生物檢測(cè)方法應(yīng)用到本地實(shí)驗(yàn)室時(shí)，在性能確認(rèn)（PQ）環(huán)節(jié)應(yīng)注意使用本實(shí)驗(yàn)室或本企業(yè)的有代表性的環(huán)境分離菌。
《中國(guó)藥典》2020年版四部通則《9201藥品微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則》[1]中提到，在微生物定性檢驗(yàn)方法的專屬性試驗(yàn)中，當(dāng)進(jìn)行控制菌的檢驗(yàn)時(shí)，還應(yīng)選擇與控制菌有類似特性的菌株作為驗(yàn)證對(duì)象。美國(guó)藥典43版1223《微生物替代檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證》[2]中也提到，在專屬性試驗(yàn)時(shí)，使用包括一定數(shù)量的能夠代表患者或產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)的微生物，包括生產(chǎn)環(huán)境分離微生物、產(chǎn)品污染微生物。
六、環(huán)境分離菌的選擇和使用原則
做好環(huán)境菌在藥品微生物檢驗(yàn)中的應(yīng)用，一是應(yīng)建立科學(xué)合理的環(huán)境菌收集、鑒定和保存方法規(guī)程，建立有代表性的環(huán)境菌數(shù)據(jù)庫(kù)，并且定期做好數(shù)據(jù)分析和回顧工作。藥品生產(chǎn)過(guò)程中的污染微生物可能來(lái)源于從原輔料到終產(chǎn)品的整個(gè)過(guò)程，環(huán)境分離菌的選擇應(yīng)充分理解藥品生產(chǎn)工藝以及相關(guān)因素，藥品生產(chǎn)過(guò)程中可能污染微生物的來(lái)源分析見(jiàn)圖1[18]。本研究團(tuán)隊(duì)在之前發(fā)表過(guò)若干研究論文，包括環(huán)境菌庫(kù)在制藥行業(yè)的應(yīng)用[19]、無(wú)菌藥品生產(chǎn)企業(yè)的環(huán)境菌分離和鑒定情況[20]、制藥環(huán)境用消毒劑對(duì)環(huán)境分離菌殺滅效應(yīng)的比較研究[21]等內(nèi)容。PDA第13號(hào)技術(shù)報(bào)告[7]詳述了環(huán)境監(jiān)控策略和環(huán)境菌的收集鑒定和分析策略。當(dāng)然，此處的“環(huán)境菌”并不只是生產(chǎn)環(huán)境分離菌，還包括原輔料、中間產(chǎn)品、終產(chǎn)品的生物負(fù)載監(jiān)控或微生物檢驗(yàn)分離的微生物、終產(chǎn)品無(wú)菌檢查陽(yáng)性和培養(yǎng)基模擬灌裝陽(yáng)性分離微生物等。
二是應(yīng)根據(jù)檢驗(yàn)項(xiàng)目、藥品的生產(chǎn)工藝和產(chǎn)品本身的特點(diǎn)，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上選擇適當(dāng)?shù)沫h(huán)境分離菌應(yīng)用于適當(dāng)?shù)臋z驗(yàn)過(guò)程中[18]。有的檢驗(yàn)項(xiàng)目用于分析高負(fù)載條件下微生物數(shù)量下降的情況，例如抑菌效力試驗(yàn)、消毒劑效能驗(yàn)證試驗(yàn)等；有的檢驗(yàn)項(xiàng)目是分析低負(fù)載水平條件下的微生物的數(shù)量，例如生物負(fù)載監(jiān)測(cè)、環(huán)境監(jiān)控、微生物限度檢查等。在藥品生產(chǎn)工藝和質(zhì)量控制的不同環(huán)節(jié)，對(duì)分離微生物有不同的應(yīng)用。例如，某企業(yè)在環(huán)境菌年度分析中發(fā)現(xiàn)，在每年的春夏季在潔凈區(qū)的環(huán)境監(jiān)控之中會(huì)出現(xiàn)霉菌的檢出，而在別的季節(jié)則沒(méi)有發(fā)現(xiàn)霉菌。那么，在對(duì)分離的霉菌進(jìn)行分離和鑒定之后，可以將霉菌應(yīng)用于目前使用的消毒劑的效能驗(yàn)證，以研究目前的消毒劑使用和清潔消毒規(guī)程是否對(duì)這種霉菌仍然有效。當(dāng)然，該霉菌亦可用于環(huán)境監(jiān)控的培養(yǎng)基的促生長(zhǎng)試驗(yàn)，以證明目前的環(huán)境監(jiān)控方法能夠在低負(fù)載水平情況下檢出這種霉菌。
三是根據(jù)微生物數(shù)據(jù)偏差（Microbial DateDeviation，MDD）調(diào)查結(jié)果，將分離微生物應(yīng)用于相應(yīng)的檢驗(yàn)之中[18]。例如，某非無(wú)菌藥品的終產(chǎn)品微生物限度檢出過(guò)程中分離出一株不可接受微生物陰溝腸桿菌。如果經(jīng)過(guò)調(diào)查該株微生物是來(lái)源于某輔料，則應(yīng)將該菌應(yīng)用于輔料檢驗(yàn)的培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)之中。如果經(jīng)過(guò)調(diào)查發(fā)現(xiàn)該株微生物室來(lái)源于生產(chǎn)過(guò)程中的人員，則應(yīng)將該菌應(yīng)用于人員的表面微生物監(jiān)控培養(yǎng)基的適用性試驗(yàn)之中。
七、 結(jié)論
一般來(lái)說(shuō)，各國(guó)藥典要求在藥品微生物檢驗(yàn)中使用標(biāo)準(zhǔn)菌株來(lái)進(jìn)行方法驗(yàn)證或結(jié)果判斷。但是，藥典指導(dǎo)原則和行業(yè)指南中又要求或建議在微生物檢驗(yàn)中增加使用環(huán)境分離菌（包括生產(chǎn)檢驗(yàn)過(guò)程中人員、環(huán)境以及樣品中分離菌）。與標(biāo)準(zhǔn)菌株相比，環(huán)境分離菌更能夠反映樣品或環(huán)境實(shí)際存在微生物的情況，使檢驗(yàn)結(jié)果能夠?qū)Ξa(chǎn)品質(zhì)量或環(huán)境做出更客觀和科學(xué)的評(píng)價(jià)。本文就環(huán)境菌在消毒劑效能驗(yàn)證、抑菌效力檢查、培養(yǎng)基方法適用性（培養(yǎng)基促生長(zhǎng)試驗(yàn)）、檢驗(yàn)方法的適用性、快速微生物檢驗(yàn)方法和微生物檢驗(yàn)替代方法驗(yàn)證等方面的應(yīng)用進(jìn)行了各國(guó)藥典和指南的綜述，并提出了環(huán)境分離菌的選擇和使用原則。希望本文能夠引起藥品研發(fā)、檢驗(yàn)、監(jiān)管和質(zhì)量控制人員的對(duì)環(huán)境分離菌作用和應(yīng)用的思考，在風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的基礎(chǔ)上考慮環(huán)境分離菌的應(yīng)用，使藥品微生物檢驗(yàn)結(jié)果更具針對(duì)性、能夠反映實(shí)際污染情況、能夠反映生物負(fù)載的實(shí)際下降情況，使藥品微生物檢驗(yàn)更好的服務(wù)于藥品的質(zhì)量控制。
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