編者按
大尺寸裝載器械可為移植的自體或異體細(xì)胞提供免疫豁免部位，為細(xì)胞提供力學(xué)及理化條件支持，維持細(xì)胞的增殖，提升細(xì)胞的治療功能，因此被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞療法。大尺寸裝載器械如膜控釋放系統(tǒng)、水凝膠、微針陣列貼片和3D支架等在內(nèi)的大尺寸裝載器械在維持細(xì)胞長期生存和加強(qiáng)其治療功能方面已經(jīng)展示出優(yōu)越的實驗室和臨床前治療效果。
中國工程院院刊《Engineering》2022年第6期刊發(fā)浙江大學(xué)顧臻教授研究團(tuán)隊的《用于細(xì)胞療法的大尺寸裝載器械》一文。文章從制備方法、材料選擇、器械特性及其對體外和體內(nèi)治療結(jié)果的影響等各方面對大尺寸器械進(jìn)行論述。由于各種疾病的治療對大尺寸器械具有不同的要求，為此，文章對大尺寸裝載器械的介紹圍繞疾病的種類展開，如糖尿病治療、心血管疾病治療、CAR-T細(xì)胞療法、3D打印水凝膠以建立血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)等。進(jìn)一步地，文章還對大尺寸器械的設(shè)計策略和功能進(jìn)行討論，對該領(lǐng)域存在的挑戰(zhàn)和機(jī)遇進(jìn)行總結(jié)和展望。
一、引言
基于天然或工程化細(xì)胞的細(xì)胞療法已被廣泛應(yīng)用于治療各種疾病，包括內(nèi)分泌失調(diào)、心血管疾病、癌癥和神經(jīng)性疾病。此類療法可直接以細(xì)胞為功能單元進(jìn)行治療，或者利用細(xì)胞分泌的生物活性分子發(fā)揮治療作用。細(xì)胞療法具備徹底改變各種慢性疾病治療理念與策略的潛力。然而，細(xì)胞經(jīng)靜脈注射或局部注射進(jìn)入體內(nèi)后，往往伴隨著在體內(nèi)或者病灶部位滯留時間短的問題，導(dǎo)致治療效果不理想，并可能引發(fā)嚴(yán)重的安全性問題。研究人員因此而設(shè)計了獨特的植入式器械，用于細(xì)胞遞送，以克服以上障礙，滿足疾病治療的多種需求。為達(dá)到以上目標(biāo)，裝載器械必須具備高效的物質(zhì)交換能力，為細(xì)胞提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如氧氣和氨基酸等；同時，在某些情況下，此類器械需要保護(hù)細(xì)胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊。此外，裝載器械也需要具備一定的機(jī)械強(qiáng)度和高的生物相容性，以保持功能結(jié)構(gòu)的完整以及避免引起不必要的免疫反應(yīng)。根據(jù)尺寸大小，該類器械一般可分為微尺寸裝載器械和大尺寸裝載器械。因為大尺寸裝載器械（某一維尺寸大于1000 μm）很容易被改造以滿足治療各種疾病的不同需求，因此本文將重點介紹此類裝載器械（圖1）。例如，被研究得較為廣泛的膜控腔室型器械，其孔隙率、孔徑大小和膜厚度可以被精準(zhǔn)地調(diào)控。而另一類叫做微針陣列貼片（microneedle array patch, MN）的器械，其微針長度、幾何形狀、密度和硬度亦能被輕易調(diào)控。
圖1. 大尺寸器械的設(shè)計及其在治療1型糖尿病、心肌梗死和癌癥免疫中的應(yīng)用。CAR：嵌合型抗原受體；hES-βC：胚胎干細(xì)胞來源的β細(xì)胞；Electroβ cells：電敏感的人源β細(xì)胞；aPDL1：抗程序性死亡受體配體1；PEG：聚乙二醇。
大尺寸器械可以將需要移植的細(xì)胞封裝在器械內(nèi)部，便于追蹤其在體內(nèi)的分布。另外，在器械失效或引起炎癥反應(yīng)時，從身體中取出大尺寸器械亦較為方便。目前，大尺寸器械已被用來遞送胰島或者胰島素分泌細(xì)胞治療糖尿病。該類器械也被用來遞送抗體分泌細(xì)胞治療神經(jīng)退行性疾病，遞送心臟基質(zhì)細(xì)胞（cardiac stromal cell, CSC）治療心臟病，遞送嵌合抗原受體T（CAR-T）細(xì)胞用于癌癥免疫治療，遞送外泌體分泌細(xì)胞治療帕金森癥。
本文中，我們將從制備方法、材料選擇、器械特性及其對體外和體內(nèi)治療結(jié)果的影響等各方面對大尺寸器械進(jìn)行論述。由于各種疾病的治療對大尺寸器械具有不同的要求，因此對器械的介紹將圍繞疾病的種類展開。進(jìn)一步地，本文對大尺寸器械的設(shè)計策略和功能進(jìn)行討論，對該領(lǐng)域存在的挑戰(zhàn)和機(jī)遇進(jìn)行總結(jié)和展望。
二、大尺寸器械用于糖尿病治療
目前，由于異體胰島供應(yīng)量少且長期服用免疫抑制類藥物伴隨著炎癥和癌癥風(fēng)險增加，因此胰島移植僅限于治療病情嚴(yán)重的胰島素缺乏性糖尿病患者。利用大尺寸裝載器械將移植胰島限制在內(nèi)部的免疫豁免部位，可以保護(hù)植入的胰島免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，或可有效減少甚至免除免疫抑制藥物的使用。此外，此方法也可用于遞送異種胰島和人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stem cell, hES-βC）制備的β細(xì)胞，或能解決胰島供應(yīng)量不足的問題。這類大尺寸器械主要包括膜控釋放系統(tǒng)、凝膠支架器械和微針陣列貼片類器械。這些器械都具備易制備、易回收的優(yōu)點。然而，植入器械表面的成纖維細(xì)胞過度生長、血管化不良和宿主免疫反應(yīng)，都可能影響大尺寸器械的臨床轉(zhuǎn)化，我們將在下面進(jìn)行一一討論。
（一）膜控釋器械用于細(xì)胞封裝
膜控釋儲庫系統(tǒng)是一類表面覆蓋薄膜的密閉腔室型器械。薄膜上分布著合適密度和尺寸的孔洞，允許機(jī)體與儲庫內(nèi)進(jìn)行營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性分子的交換。膜控釋儲庫系統(tǒng)尺寸較大，因此可以比較方便地對其外在大小、膜厚度以及孔洞尺寸進(jìn)行調(diào)控。迄今為止，膜控釋儲庫系統(tǒng)在細(xì)胞療法上已經(jīng)取得了重大進(jìn)展。例如，一種裝載了胰島素分泌細(xì)胞的器械已被開發(fā)出來，用以治療不同類型的糖尿病。此外，研究人員正在研究應(yīng)用降低免疫反應(yīng)、提供氨基酸和氧氣的策略等以提高植入細(xì)胞的存活率和增強(qiáng)其治療功能。
1. 具有合適膜孔大小的生物相容性器械
近來，利用兩層膜及其中間的腔室而制備的腔室型器件被研制出來。此類器械植入體內(nèi)后，若其表面不加以修飾，則易誘發(fā)機(jī)體的異物排斥反應(yīng)，造成器械被纖維化組織包裹。尤其是膜表面增生的纖維化組織易堵塞膜孔，從而影響膜兩側(cè)物質(zhì)的交換。因此，選擇具有較少異物反應(yīng)的膜材料，是保證移植物成活和器械在失效后被順利取出的關(guān)鍵。另外膜上孔徑的大小則決定膜兩側(cè)物質(zhì)的交換速率，從而影響到器械內(nèi)細(xì)胞的生存、活性及功能。然而，器械與外界所交換的物質(zhì)的尺寸通常介于細(xì)胞因子（約2 nm）與細(xì)胞直徑（約10 μm）的大小之間，何種孔徑大小的膜，既能保證良好的物質(zhì)交換，又能最大限度地減少宿主免疫系統(tǒng)對移植細(xì)胞的攻擊，仍然存在較大爭議。
在最近的一項工作中，Chang等將兩層聚己內(nèi)酯（polycaprolactone, PCL）納米孔膜貼合，制備了柔性雙層U型器械[圖2（a）~（c）]。與聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene, PTFE）膜（孔徑為400 nm）相比，研究人員所研發(fā)的膜孔徑為20 nm和200 nm的器械可以更有效地抑制免疫球蛋白通過，因此能更好地保護(hù)細(xì)胞免受宿主免疫系統(tǒng)的攻擊[圖2（d）]。由于其較好的物質(zhì)交換能力，封裝在器械中的hES-βC可以在培養(yǎng)基中存活5周以上。盡管孔徑為20 nm的膜比孔徑為200 nm膜表現(xiàn)出對胰島素和C肽更明顯的跨膜運輸阻礙作用[圖2（e）]，但膜孔徑為20 nm和200 nm的器械均達(dá)到約為1.5的葡萄糖刺激指數(shù)（glucose stimulation index, GSI）[圖2（f）]。將此膜控釋器械植入C57BL/6J小鼠皮下一個月后，該器械周圍沒有明顯的纖維化組織沉積。4個月后，器械周圍血管密度增加而巨噬細(xì)胞募集減少[圖2（g）]。值得注意的是，當(dāng)該器械的膜孔徑為200 nm時，該器械可以將細(xì)胞封裝在內(nèi)長達(dá)6個月而不泄露。但是，該過程伴隨著大約75%的細(xì)胞損失[圖2（h）]。在免疫缺陷非肥胖糖尿病-重度聯(lián)合免疫缺陷（NOD-SCID）小鼠中植入此器械6個月后，經(jīng)腹腔給小鼠注射葡萄糖，可以觀察到葡萄糖刺激的C肽分泌[圖2（i）、（j）]，且GSI在2~7之間[圖2（k）]。
圖2. 一種用于hES-βC包封的PCL雙層膜器械。（a）雙層膜器械的示意圖。（b）PCL（聚己內(nèi)酯）膜的代表性掃描電子顯微鏡圖像。（c）具有納米多孔層和微孔層的PCL膜橫截面的代表性掃描電子顯微鏡圖像。（d）7天內(nèi)免疫球蛋白跨膜擴(kuò)散率。（e）暴露于葡萄糖溶液（2 mmol·L-1和20 mmol·L-1）后，封裝在hES-βC中C肽的分泌量（n = 4）。（f）在膜孔徑為20 nm (NID-20)和200 nm (NID-200)的材料中負(fù)載的hES-βC的葡萄糖刺激指數(shù)（GSI）。該裝置依次暴露在2 mmol·L-1和20 mmol·L-1的葡萄糖溶液中30 min。GSI：在20 mmol·L-1和2 mmol·L-1中C肽釋放量的比值，并定義為葡萄糖刺激指數(shù)。（g）PCL膜皮下植入C57BL/6J小鼠4個月后，細(xì)胞核（DAPI）、膠原蛋白（COL1A1）、新生血管（vWF）和巨噬細(xì)胞（F4/80）標(biāo)志物的免疫熒光染色圖像。白色虛線表示PCL膜的位置。（h）器械植入6個月后細(xì)胞的損耗量，Radiance：生物發(fā)光強(qiáng)度。（i）腹腔糖耐量實驗中血清C肽的釋放量。實驗組小鼠分別植入NID封裝的hES-βC 1周和6個月，未移植的小鼠作為對照（CTRL），并在實驗前禁食（n = 4）。（j）植入NID封裝的hES-βC 6個月并禁食過夜的小鼠（n = 4）在糖耐量實驗前和60 min后的血清C肽水平。（k）植入NID封裝的（NID組）或裸露的hES-βC（CTRL組）6個月后的小鼠的GSI（n = 4）。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001。ns：無統(tǒng)計學(xué)意義。
在另一項研究工作中，研究人員制備了一種異物反應(yīng)較弱、對抗體和細(xì)胞因子具有高滲透性但同時又能夠限制細(xì)胞滲漏的器械。該器械由兩部分組成：①深度為150 µm的聚二甲硅氧烷（polydimethylsiloxane, PDMS）儲庫；②具有不同孔徑的多孔聚碳酸酯（PCTE）膜[圖3（a）、（b）]。隨后，研究人員將能夠分泌小鼠促紅細(xì)胞生成素的工程化HEK293T細(xì)胞（HEKepo細(xì)胞）封裝到該器械中。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞能夠穿透孔徑為1 µm的膜而浸潤到器械內(nèi)腔。將孔隙減小到0.8 µm，該PCTE膜則可以較好地阻止免疫細(xì)胞進(jìn)入器械內(nèi)。值得注意的是，在經(jīng)各組器械治療的小鼠體內(nèi)，均檢測到抗HEKepo細(xì)胞的抗體，但均未引起明顯的移植物損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將膜孔徑縮小到0.4 μm，能夠更加有效地阻止免疫細(xì)胞浸潤到器械內(nèi)部，同時又實現(xiàn)了氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)和生物活性分子的交換。
圖3. 用于細(xì)胞和胰島遞送的膜控腔室型器械。（a）微孔裝置的示意圖。（b）裝置的代表性圖像：用于小鼠實驗的代表性裝置圖片（左上）；典型的橫截面掃描電子顯微鏡圖像（右），偽彩顯示膜、細(xì)胞和硅膠體的位置；膜的偽彩圖像（左下）。（c）膜表面的改性方法。（d）用負(fù)載有胰島細(xì)胞（200~300當(dāng)量）的裝置治療的1型糖尿病小鼠的血糖水平，n = 5。（e）健康小鼠和裝置治療15天的糖尿病小鼠在糖耐量實驗后的血糖水平。（f）對（e）數(shù)據(jù)的分析結(jié)果。ATRP：原子轉(zhuǎn)移自由基聚合；ARGET：通過電子轉(zhuǎn)移再生的激活劑；CBMA：甲基丙烯酸羧基乙酯；SBMA：甲基丙烯酸磺基乙酯；MPC：2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸膽堿；AUC：曲線下面積。
隨后，研究人員進(jìn)一步用三種兩性離子聚合物和四氫吡喃苯三唑（tetrahydropyran phenyl triazole, THPT）衍生聚合物對器械膜進(jìn)行修飾，以減少異物反應(yīng)[圖3（c）]。將器械植入C57BL/6J小鼠體內(nèi)后，THPT衍生聚合物修飾的膜在預(yù)防纖維化和維持細(xì)胞存活方面優(yōu)于兩性離子聚合物修飾膜。研究人員將胰島與海藻酸鈉凝膠混合并封裝在器械中，然后將其植入鏈脲佐菌素（streptozotocin, STZ）誘導(dǎo)的糖尿病C57BL/6J小鼠的腹腔內(nèi)。經(jīng)THPT修飾的器械可以維持小鼠正常血糖的平均時間為75天，遠(yuǎn)高于未修飾器械的21天[圖3（d）]。此外，在葡萄糖篩查試驗中，經(jīng)THPT修飾的器械治療的小鼠與健康小鼠一樣，能夠在120 min內(nèi)將小鼠血糖恢復(fù)到正常范圍[圖3（e）和（f）]。
2. 可重復(fù)充填氧氣的器械
充足的氧氣供應(yīng)對植入細(xì)胞的生存至關(guān)重要，因此在設(shè)計器械時需要將其納入考量范圍內(nèi)。其中，研究人員證明，向器械中吹入氧氣是一種可行的方法。Ludwig等開發(fā)了一款名為“β-Air”的器械。該器械內(nèi)包含一個可反復(fù)充填富氧空氣的儲罐。氧氣可以緩慢地穿過PTFE隔膜，到達(dá)胰島細(xì)胞所在的隔室。將德國長白母豬胰島封裝在“β-Air”器械中，隨后植入到Göttingen小型豬皮下，并取出檢驗。當(dāng)將該器械先后暴露于3.3 mmol·L?1和16.7 mmol·L?1的葡萄糖溶液中時，植入前和13天后取出的器械的GSI分別為3.5和6.7。隨后，研究人員將該裝置與生長激素釋放激素（growth hormone-releasing hormone, GHRH）激動劑結(jié)合，以增強(qiáng)植入后β細(xì)胞的生存和細(xì)胞增殖。研究發(fā)現(xiàn)，包裹胰島的凝膠的表面積、輸送氣體方法、氣體成分均會影響細(xì)胞活力。例如，當(dāng)胰島密度為每平方厘米1000個且厚度為500 µm時，頻繁的空氣輸注或者開放型腔室均可有效地維持細(xì)胞活性。然而，當(dāng)胰島密度超過每平方厘米2000個時，在無空氣輸送或者僅輸送含氧量為20%或30%的空氣時，正常血糖的維持時間不會超過兩天。研究人員進(jìn)一步將器械推進(jìn)到臨床試驗，且給藥劑量設(shè)定為每千克體重2100個胰島。如果每天更新空氣，移植的器械可以將功能維持10個月以上。然而，由于植入胰島數(shù)量不足，C肽的基線水平僅為(0.04 ± 0.03) mmol·L-1，遠(yuǎn)低于健康個體的平均水平。移除器械后，植入部位有一個薄的纖維囊，血管化情況良好且無炎癥跡象。值得注意的是，在取出的移植物中，胰島仍保持著正常的形態(tài)，分布著正常形態(tài)與功能的α和β細(xì)胞。
3. 預(yù)血管化器械
預(yù)血管化是另一種增強(qiáng)氧氣和營養(yǎng)供應(yīng)的有效策略。Pepper等發(fā)現(xiàn)，將植入部位預(yù)血管化，可以顯著提高植入胰島的存活率。他們設(shè)計了一種生物相容性的細(xì)胞袋（cell pouch, CP）器械作為胰島移植的免疫隔離區(qū)和預(yù)血管化部位。將CP預(yù)植入小鼠皮下4~5周，促使擬植入部位預(yù)先血管化。隨后，利用負(fù)載胰島的CP器械治療糖尿病小鼠，可將小鼠的血糖逐漸恢復(fù)到水平正常。移植100天后，95%的小鼠血糖恢復(fù)到正常水平。若此時將CP器械移除，則小鼠在1周內(nèi)又會回到高血糖水平。胰島移植到CP中后其功能依然正常。相反，直接進(jìn)行細(xì)胞移植不能逆轉(zhuǎn)糖尿病。然而，本研究中沒有對未預(yù)血管化的CP的治療效果進(jìn)行評估。
間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell, MSC）和富血小板血漿（platelet-rich plasma, PRP）也可以促進(jìn)血管生成。受此啟發(fā)，研究人員以生物相容性較高的聚乳酸（polylactic acid, PLA）為原料，利用3D打印技術(shù)制備出腔室型器械。微通道均勻分布在器械表面，保證新形成的血管能夠滲透到細(xì)胞庫中。在該器械中先裝入PRP和MSC，然后再將器械移植到大鼠和非人靈長類動物的皮下組織中。預(yù)裝載了PRP和MSC的器械表面形成了密集的血管網(wǎng)絡(luò)，從而能夠提供一個快速進(jìn)行氧氣交換的微環(huán)境，為提高隨后裝載的胰島或能夠分泌睪酮的Laydig細(xì)胞的存活率提供了條件。此外，免疫抑制分子誘導(dǎo)的局部免疫抑制微環(huán)境可以與血管網(wǎng)絡(luò)協(xié)同作用，進(jìn)一步提高所移植的同種異體細(xì)胞的存活率。Paez-Mayorga等設(shè)計了一種皮下可植入的雙儲庫器械。該器械包含一個中央的細(xì)胞儲庫。中央儲庫兩側(cè)的空間則裝載了MSC和免疫抑制劑CTLA4Ig。這種設(shè)計不僅可以增強(qiáng)血管生成，還能夠建立免疫抑制微環(huán)境來保護(hù)包裹在裝置內(nèi)的同種異體Leydig細(xì)胞。
Song等則開發(fā)了一種微血管網(wǎng)篩。將該網(wǎng)篩覆蓋于器械表面，可促進(jìn)細(xì)胞附著，加速新生血管生成，促進(jìn)氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的供給。在該研究中，纖維蛋白基質(zhì)中培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell, HUVEC）可以在微柱基質(zhì)上自組裝形成血管網(wǎng)。兩周后，該血管網(wǎng)狀物可在器械表面誘導(dǎo)形成致密的具有正常功能的血管網(wǎng)。將裝載了胰島和覆蓋了微血管網(wǎng)的器械移植到SCID-Beige小鼠的皮下后，小鼠的血糖可以保持在正常水平達(dá)3個月。
4. 無線生物電子器械
上述器械的糖響應(yīng)胰島素釋放功能均建立在β細(xì)胞內(nèi)在的糖響應(yīng)控制機(jī)制之上。若想利用外部刺激來操縱這個信號環(huán)路，從而控制胰島素釋放，仍面臨較大挑戰(zhàn)。在機(jī)體內(nèi)，朗格漢斯（Langerhans）胰島內(nèi)的β細(xì)胞能夠響應(yīng)血糖波動，并相應(yīng)地調(diào)整其胰島素的分泌速率。其機(jī)制如下：當(dāng)血糖升高時，經(jīng)葡萄糖轉(zhuǎn)運體運輸，葡萄糖加速流入β細(xì)胞，隨后在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生大量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate, ATP），導(dǎo)致三磷酸腺苷/二磷酸腺苷（adenosine diphosphate, ADP）比值升高。然后，ATP敏感的K+通道關(guān)閉，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，誘導(dǎo)電壓門控鈣離子通道（Cav）打開，促使鈣離子加速流入，刺激胰島素分泌。
基于這一原理，Krawczyk等設(shè)計了一種電子器械，并裝載了電壓敏感的人β細(xì)胞（electrosensitive human β-cells, Electroβ cells）和定制的生物電子接口，旨在遠(yuǎn)程控制胰島素釋放以治療1型糖尿病（type 1 diabete, T1D）[圖4（a）]。研究人員選擇HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，在細(xì)胞膜上表達(dá)一個L-型電壓門控鈣離子通道，并使其能夠分泌人胎盤堿性磷酸酶（human placental-secreted alkaline phosphatase, SEAP）作為報告蛋白。與只表達(dá)電壓門控鈣離子通道的細(xì)胞相比，表達(dá)電壓門控鈣離子通道Cav1.2和內(nèi)向整流鉀離子通道Kir2.1的HEK293T細(xì)胞表現(xiàn)出較低的SEAP本底水平，并能夠?qū)崿F(xiàn)膜去極化觸發(fā)的SEAP釋放[圖4（b）和（c）]。隨后，選擇具有正常胰島素分泌機(jī)制但沒有葡萄糖感應(yīng)能力的β細(xì)胞系變體INSVesc進(jìn)行基因改造，獲得同時表達(dá)Cav1.2和Kir2.1通道以及proinsulin-NanoLuc的Electroβ細(xì)胞系，實現(xiàn)胰島素的可控分泌并方便對其進(jìn)行監(jiān)測[圖4（d）~（f）]。
隨之，一種用于體內(nèi)植入的無線電刺激器械也被設(shè)計和制備出來[圖4（a）]。在該大尺寸器械中，鉑電極被安裝在包裹Electroβ細(xì)胞的半透膜兩側(cè)，可以對細(xì)胞施加電脈沖刺激。此外，一個配電盤（switchboard）被連接到該設(shè)備，以產(chǎn)生用于電刺激的方形單極脈沖。在糖耐量測試中，體內(nèi)植入器械的糖尿病小鼠在電刺激60 min后，其血糖迅速恢復(fù)到正常水平，并呈現(xiàn)出類似于經(jīng)人胰島治療的血糖反應(yīng)曲線[圖4（g）]。通過實時血糖監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，只要電刺激30 min，器械在1 h內(nèi)就能將糖尿病小鼠的血糖恢復(fù)至正常水平[圖4（h）]。將含有Electroβ細(xì)胞的器械移植后3周內(nèi)，器械表現(xiàn)出良好的生物相容性，其免疫細(xì)胞浸潤或器械相關(guān)的細(xì)胞毒性基本可以忽略不計。該系統(tǒng)的優(yōu)勢在于，它能對血液中葡萄糖水平進(jìn)行實時監(jiān)測并依外部控制而做出響應(yīng)。然而，擴(kuò)大這些設(shè)備的生產(chǎn)規(guī)?？赡芫哂幸欢ㄌ魬?zhàn)性。
圖4. 一種裝有β細(xì)胞的無線控制的生物電子大尺寸器械。（a）該器械的三維模型。（b）不同鈣離子通道的報告蛋白分泌量的比較。（c）表達(dá)Cav1.2的細(xì)胞或共同表達(dá)Cav1.2和Kir2.1的細(xì)胞的性能比較。Cav1.2、Cav1.3 [42a]和Cav1.3 [?42]是三種L型電壓門控鈣通道。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n = 3；**P < 0.01，***P < 0.001。（d）暴露在不同的葡萄糖溶液中，Electroβ細(xì)胞中胰島素釋放量。數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，n = 3；**P < 0.01，***P < 0.001。（e）在電刺激下，Electroβ細(xì)胞的胰島素分泌途徑。PhEF1α-α2/β1-P2A-β3-pA和PhEF1α-α1C-P2A-Kir2.1-pA是表達(dá)Cav1.2和Kir2.1的轉(zhuǎn)基因結(jié)構(gòu)域。（f）Electroβ細(xì)胞的代表性透射電子顯微鏡圖像。白色箭頭指向含有胰島素的囊泡。（g）葡萄糖耐量實驗。植入48 h后，裝置中的Electroβ細(xì)胞被電刺激60 min（紅色區(qū)域）；然后，腹腔注射葡萄糖后監(jiān)測小鼠的血糖水平。野生型（wild type），n = 8；1型糖尿病小鼠，植入物電刺激（T1D, implant electrostimulated），n = 6；1型糖尿病小鼠，空植入物（T1D, empty），n = 10；胰島（islets），n = 3。（h）血糖的實時監(jiān)測記錄數(shù)據(jù)。植入裝置的空腹1型糖尿病小鼠被電刺激30 min，并監(jiān)測血糖水平。綠色區(qū)域表示正常血糖范圍。野生型（wild type），n = 6；無刺激（no stimulation），n = 6；電刺激（electrostimulated），n = 7。
（二）微針陣列貼片用于細(xì)胞遞送
微針陣列貼片是另一種大尺寸器械，已經(jīng)被廣泛研究用于無痛地遞送胰島素、疫苗、抗癌藥物、活細(xì)胞和其他種類的藥物，治療多種疾病。貼片表面均勻地分布著微針，這些微針能夠刺入皮膚，因此賦予微針陣列貼片經(jīng)皮給藥的能力。此外，微針陣列貼片可以承擔(dān)通信功能，讓微針陣列貼片上負(fù)載的細(xì)胞能夠感知微針?biāo)诮M織的生理環(huán)境的變化。
Ye等利用微針陣列貼片負(fù)載能夠產(chǎn)生胰島素的β細(xì)胞，用于治療Ⅰ型糖尿病[圖5（a）]。在該方法中，微針陣列貼片以甲基丙烯酸酯化的透明質(zhì)酸（hyaluronic acid, HA）為原料制備而成[圖5（b）]，并在脫模后進(jìn)行紫外線交聯(lián)。為了維持β細(xì)胞的活性，細(xì)胞被包裹在海藻酸鈉微凝膠中，然后再貼合于微針陣列貼片的背面[圖5（c）]。另外，微針中還額外整合了葡萄糖信號放大器（glucose-signal amplifier, GSA）。將該貼片貼于皮膚后，微針能夠插入真皮組織中，使整個器械獲得實時感知血糖波動并響應(yīng)釋放藥物的能力。在Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，負(fù)載細(xì)胞的微針陣列貼片能夠感知高血糖并隨之釋放胰島素，使血糖維持在正常范圍的時間達(dá)到10 h以上[圖5（d）]。重要的是，連續(xù)使用兩個微針陣列貼片并不會導(dǎo)致小鼠低血糖[圖5（e）]。在該器械中，微針陣列貼片和海藻酸鈉微凝膠能夠?qū)?beta;細(xì)胞與宿主的免疫系統(tǒng)隔離，減少免疫排斥反應(yīng)。此外，微針陣列貼片的多孔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)能夠幫助β細(xì)胞感受組織液的葡萄糖濃度變化。然而，要想將該器械推到臨床應(yīng)用，還需要做很多工作，包括如何擴(kuò)大化生產(chǎn)。
圖5. 用于細(xì)胞和胰島遞送的微針陣列貼片。（a）葡萄糖響應(yīng)機(jī)制示意圖。[Glucose]和[O2]分別代表葡萄糖和O2的濃度。GOx：葡萄糖氧化酶；AM：淀粉酶；GA：葡糖淀粉酶。（b）代表性掃描電子顯微鏡圖像。（c）負(fù)載細(xì)胞的微針貼片的熒光圖像。GSAs用羅丹明標(biāo)記，細(xì)胞用鈣-α-淀粉酶標(biāo)記。（d）使用微針貼片的1型糖尿病小鼠的在體血糖調(diào)節(jié)能力。MN w/o GRS：空MN；MN L-GRS：微針貼片與細(xì)胞凝膠；MN S-GRS：無細(xì)胞微針貼片；MN L-S GRS：裝有凝膠的微針貼片；MN L-S GRS (w/o GOx)：MN L-S GRS不使用葡萄糖氧化酶（GOx）；MN L-S GRS（不使用AM）。MN L-S GRS：不使用直鏈淀粉。（e）1型糖尿病小鼠在接受兩次連續(xù)的微針貼片治療后的血糖水平。
（三）中空多孔纖維
理想的大尺寸器械表面應(yīng)具備致密的血管網(wǎng)絡(luò)，使器械內(nèi)與周圍生理環(huán)境之間可以順暢地進(jìn)行物質(zhì)交換。與此相似，增加裝置的比表面積也可以促進(jìn)物質(zhì)交換。為此，Tan等利用膜表面孔徑為(0.27 ± 0.02) μm的中空微孔聚醚砜纖維制備了一種大尺寸器械。纖維的外表面修飾了抗炎細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-4（IL-4），可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化。此外，利用纖維連接蛋白（fibronectin, FN）修飾纖維的內(nèi)表面構(gòu)建仿生微環(huán)境，促進(jìn)β細(xì)胞在纖維膜內(nèi)表面黏附并形成單細(xì)胞層。修飾前后，纖維的孔隙大小沒有發(fā)生明顯變化，卻使纖維內(nèi)的β細(xì)胞數(shù)量增加了10倍，證明這一策略具有較高的可行性。
類似地，Wang等設(shè)計了一種納米纖維器械，可用于自體、同種異體或異種胰島移植，治療Ⅰ型糖尿病。該裝置由表面的納米纖維膜和核心的海藻酸鈉水凝膠組成。納米纖維膜由熱塑性硅樹脂-聚碳酸酯-聚氨酯制成。納米纖維膜的孔徑小于500 nm，可防止免疫細(xì)胞浸潤。在Ⅰ型糖尿病小鼠模型中，腹腔植入該器械能夠逆轉(zhuǎn)免疫缺陷和免疫正常小鼠的糖尿病癥狀。另外，通過微創(chuàng)手術(shù)將該器械移植到實驗狗的腹腔中。兩周后，在取出的器械中仍能觀察到存活的人β細(xì)胞，但同時也觀察到免疫排斥反應(yīng)。
（四）水凝膠
水凝膠是一種能夠在水或生物流體中膨脹的交聯(lián)高分子網(wǎng)絡(luò)。水凝膠的親水鏈可以容納大量的水分子，因此有足夠的空間成為藥物、蛋白質(zhì)和細(xì)胞的“儲庫”。水凝膠可以由天然大分子如海藻酸鈉和明膠，或者合成聚合物如聚乙二醇[poly(ethylene glycol), PEG]和聚（2-羥乙基甲基丙烯酸酯）[poly(2-hydroxyethyl methacrylate), PHEMA]制備。目前針對水凝膠的研究主要集中在改善其機(jī)械強(qiáng)度，減少異物反應(yīng)及促進(jìn)水凝膠與機(jī)體間的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的交換速率，目標(biāo)是提高細(xì)胞的存活率和維持器械性能。
1. 聚合物線增強(qiáng)海藻酸鈉水凝膠強(qiáng)度
海藻酸鈉是目前應(yīng)用最廣泛的水凝膠原料，具有良好的生物相容性。但是，海藻酸鈉水凝膠存在一些局限性。例如，海藻酸鈉不可避免地含有脂多糖、肽聚糖和脂磷壁酸，而這些物質(zhì)可能被免疫系統(tǒng)識別為外來分子，導(dǎo)致異物反應(yīng)和器件表面纖維化。此外，海藻酸鈉水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度較低，導(dǎo)致水凝膠器械不易植入或移除。目前，研究人員已經(jīng)開發(fā)了一些策略，來提高海藻酸鈉水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。此外，新的生物相容性材料也在開發(fā)中，以替代海藻酸鈉并解決其體內(nèi)應(yīng)用面臨的局限性。
An等開發(fā)了一種能夠釋放鈣離子的納米多孔聚合物線。將聚合物線做成螺紋線結(jié)構(gòu)，并在其表面覆蓋封裝有胰島的海藻酸鈉水凝膠，從而獲得螺紋線增強(qiáng)的海藻酸鈉凝膠纖維[圖6（a）]。海藻酸鈉水凝膠能夠牢固地黏附在納米多孔線上[圖6（b）]，且胰島能夠在該器械中存活[圖6（c）]。在葡萄糖溶液中，該器械能夠模擬胰島功能，實現(xiàn)胰島素的動態(tài)糖響應(yīng)分泌。在I型糖尿病小鼠實驗中，將負(fù)載大鼠胰島的海藻酸鈉凝膠纖維植入小鼠腹腔中，兩天后血糖即恢復(fù)至正常范圍內(nèi)，且在4周內(nèi)將血糖維持在正常水平[圖6（d）]。移植后第28天，進(jìn)行腹腔葡萄糖耐量試驗（intraperitoneal glucose tolerance test, IPGTT）（2 g·kg-1），糖尿病小鼠和健康小鼠的血糖在2 h內(nèi)均回到正常水平[圖6（e）]。負(fù)載人胰島的海藻酸水凝膠纖維能夠逆轉(zhuǎn)免疫缺陷型的糖尿病SCID-Beige小鼠的高血糖[圖6（f）]，并維持正常血糖超過4個月。在實驗狗中，將10 in（注：1 in=2.54 cm）長的海藻酸鈉水凝膠纖維放置在肝臟和隔膜之間，移植的胰島能夠存活，并實現(xiàn)糖響應(yīng)型的胰島素分泌[圖6（g）]。
圖6. 一種用于細(xì)胞和胰島遞送的螺紋線增強(qiáng)型海藻酸鈉水凝膠。（a）該器械的示意圖。TRAFFIC：用于封裝胰島的線增強(qiáng)海藻酸纖維。（b）代表性的胰島裝載器械圖像。（c）封裝在纖維中的胰島的活/死染色。（d）糖尿病的C57BL/6J小鼠移植封裝大鼠胰島器械后的血糖水平，n = 6~10，*P < 0.05。（e）在取回裝置前，接受葡萄糖注射后的糖尿病小鼠的血糖水平，n = 4~5，*P < 0.05（糖尿病對照vs大鼠胰島器件），#P > 0.05（非糖尿病對照vs器件治療的大鼠）。（f）糖尿病SCID-Beige小鼠移植各種類型的人胰島后的血糖水平，n = 4~21，*P < 0.05（人胰島器械vs糖尿病對照），#P > 0.05（人胰島-腎膠囊vs人胰島器械）。（g）封裝在纖維凝膠中的胰島植入前和植入后，小鼠體外葡萄糖刺激的胰島素分泌情況，n = 3，*P < 0.05。所有數(shù)據(jù)都是以平均值±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。
2. 盤狀三唑兩性離子水凝膠
另一種提高水凝膠機(jī)械強(qiáng)度的方法是研制大塊狀水凝膠。在眾多水凝膠中，三唑兩性離子水凝膠具有較高的拉伸性能和機(jī)械穩(wěn)定性，因此受到研究者的青睞。Liu等開發(fā)了多種基于三唑兩性離子水凝膠的盤狀水凝膠用于胰島移植，其原料包括聚季銨化三唑羧基甜菜堿丙烯酰胺[poly(quaternized triazole carboxybetaine acrylamide), P(qTR-CB)]、聚三唑羧基甜菜堿丙烯酰胺[poly(triazole carboxybetaine acrylamide), P(TR-CB)]和聚三唑磺基甜菜堿丙烯酰胺[poly(triazole sulfobetaine acrylamide)或P(TR-SB)]。通過提高合成過程中的單體濃度，可以促進(jìn)強(qiáng)離子鍵的形成，因此能夠增強(qiáng)凝膠的機(jī)械強(qiáng)度。三唑磺基甜菜堿丙烯酰胺（triazole sulfobetaine acrylamide, TR-SB）制備的P(TR-SB)水凝膠，具有比聚羧基甜菜堿（polycarboxybetaine, PCB）水凝膠高20倍的斷裂應(yīng)變，且其在健康小鼠皮下植入后幾乎沒有異物反應(yīng)。在糖尿病小鼠植入負(fù)載大鼠胰島的P(TR-SB)凝膠后，小鼠的血糖可以維持在正常水平長達(dá)一個月。與之對比，包裹于海藻酸鈉凝膠中的胰島則無法持續(xù)維持血糖正常。取出該凝膠后，將其先后置于2.8 mmol·L-1和16.7 mmol·L-1的葡萄糖溶液中并培養(yǎng)60 min，發(fā)現(xiàn)胰島素分泌量增加約1.5倍。此外，P(TR-SB)凝膠在植入小鼠后，其周圍的血管化程度也增長明顯。
3. 不可降解的聚乙二醇水凝膠
為了促進(jìn)器件周圍的血管化，Weaver等制備了一種蛋白酶促降解型聚乙二醇水凝膠，并在水凝膠中加入精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp, RGD）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）。RGD為胰島細(xì)胞提供黏附位點，而VEGF則可刺激器件周圍血管網(wǎng)絡(luò)的形成。此外，研究人員利用這些材料制造了一個多層胰島封裝器械。該器械主要包括兩部分：①器械核心為封裝了胰島的不可降解聚乙二醇水凝膠；②核心外部則包裹了一層促血管網(wǎng)絡(luò)生成的可降解聚乙二醇凝膠。相比于傳統(tǒng)的海藻酸鈉水凝膠，該聚乙二醇水凝膠能夠更好地維持胰島活性。將包裹了雄性Lewis大鼠胰島的器械植入雌性Lewis大鼠腹腔脂肪墊中，可以發(fā)現(xiàn)，外層修飾有VEGF聚乙二醇水凝膠的器械能夠更好地促進(jìn)血管密度的增加。
4. 多孔管狀水凝膠
如前所述，增加器械的比表面積可以促進(jìn)器械內(nèi)的胰島與周圍環(huán)境的物質(zhì)交換。Naficy等制備了一種由聚丙烯乙二醇（polypropylene glycol, PPG）和親水聚氨酯（hydrophilic polyurethane, HPU）構(gòu)成的可移除式多孔管狀器械，用于β細(xì)胞或胰島移植。HPU-PPG水凝膠剛度范圍為100 ~ 400 kPa，可提供機(jī)械支撐。為了獲得該器械，首先需要制備氯化鈉顆粒預(yù)填充的水凝膠，再用水沖洗除去氯化鈉晶體，從而獲得多孔結(jié)構(gòu)。這些孔洞中可以填充海藻酸鈉水凝膠，用于進(jìn)一步負(fù)載β細(xì)胞系或胰島細(xì)胞簇。實驗發(fā)現(xiàn)，海藻酸鈉水凝膠與內(nèi)部細(xì)胞具有良好的生物相容性。體外實驗結(jié)果表明，相比于普通RPMI 1640培養(yǎng)基，含33 mmol·L?1葡萄糖溶液的HEPES緩沖液[Krebs-Ringer Bicarbonate N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-2-ethane sulfonic acid buffer]可以更好地刺激負(fù)載在器械中的胰島釋放出胰島素，使24 h內(nèi)胰島素釋放量翻倍。結(jié)果表明，胰島可能比β細(xì)胞系具有更好的糖響應(yīng)胰島素釋放性能。此外，水凝膠不易降解，在植入后可以完整取出。
三、大尺寸器械用于心血管疾病治療
心肌梗死（myocardial infarction, MI）會造成心肌細(xì)胞損傷，致使約36%的MI幸存者面臨較高的心衰風(fēng)險。干細(xì)胞療法能夠通過旁分泌機(jī)制，分泌再生因子治療MI，改善心臟功能，預(yù)防心力衰竭。因此，延長MI部位干細(xì)胞的滯留時間，具有改善干細(xì)胞治療MI療效的潛力。其中，可注射支架和心臟貼片已被開發(fā)用于提高細(xì)胞遞送效率?？勺⑸渲Ъ芸蔀橹踩氲募?xì)胞提供生理支持，誘導(dǎo)血管形成，緩解纖維化。心臟補(bǔ)片可以提供直接的機(jī)械支持來增強(qiáng)心臟功能，并構(gòu)建一個適合細(xì)胞生長的微環(huán)境。
（一）心臟補(bǔ)片用于MI治療
Kim等將脫去細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)（decellularized cell-derived extracellular matrice, CDM）沖壓在聚乙烯醇（polyvinyl alcohol, PVA）水凝膠上，獲得可拉伸的細(xì)胞外基質(zhì)薄膜，用于干細(xì)胞的遞送。CDM能夠促進(jìn)細(xì)胞黏附，提高NIH-3T3成纖維細(xì)胞在器械內(nèi)的增殖速度。在大鼠MI模型中，負(fù)載間充質(zhì)干細(xì)胞器械的治療效果優(yōu)于直接注射或與FN/PVA水凝膠共用的間充質(zhì)干細(xì)胞，顯示了該器械的優(yōu)越性。基于心肌細(xì)胞外基質(zhì)和甲基丙烯酸明膠（gelatin methacrylate, GelMA），Bejleri等也設(shè)計了一種生物打印的心臟補(bǔ)片，用于遞送心臟祖細(xì)胞。這種心臟補(bǔ)片具有足夠的機(jī)械強(qiáng)度，能夠有效促進(jìn)新血管再生，并能在體內(nèi)保留14天以上。
Song等開發(fā)了一種引入導(dǎo)電高分子聚丙烯酸的氧化海藻酸鈉-明膠水凝膠，具有良好的自愈性、生物相容性、導(dǎo)電能力以及機(jī)械穩(wěn)定性。在凝膠內(nèi)培養(yǎng)的新生兒心肌細(xì)胞表現(xiàn)出改善的分化肌節(jié)和細(xì)胞間接觸，以及組織良好的肌節(jié)α-肌動蛋白和定向分布的肌節(jié)。該貼片能夠顯著抑制心肌纖維化，增加左室壁厚度，促進(jìn)血管生成。Song等也利用重編程的成纖維細(xì)胞制備了預(yù)血管化的心臟補(bǔ)片。
此外，為了避免因器械內(nèi)細(xì)胞活力降低導(dǎo)致的治療功能減弱或喪失、增加貼片的保存時間與擴(kuò)展應(yīng)用場景，Huang等研制了一種可以冷凍保存的、負(fù)載并能夠分泌細(xì)胞因子的心臟補(bǔ)片用于MI后的心臟修復(fù)。
（二）微針陣列貼片用于MI治療
如何實現(xiàn)貼片與MI部位的物質(zhì)交換效率以提高治療效果仍具有較大挑戰(zhàn)。為了促進(jìn)微針貼片與MI給藥部位的物質(zhì)交換，Tang等制備了一種負(fù)載CSC的微針陣列貼片，方便CSC與MI部位細(xì)胞的物質(zhì)交換，促進(jìn)細(xì)胞再生因子向受損心肌的運輸[圖7（a）]。微針陣列貼片由易結(jié)晶的PVA制備而成 [圖7（b）]。貼片上的微針可以刺入心肌組織，吸收組織間隙液發(fā)生微腫脹，在凝膠內(nèi)部形成微米級通道，允許貼片與宿主心肌細(xì)胞直接進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞。CSC被包裹在位于MN貼片背面的生物相容性纖維蛋白凝膠中[圖7（c）]，并保持良好的存活率[圖7（d）]。與直接進(jìn)行心肌組織內(nèi)注射相比，這種方法延長了CSC在損傷部位的滯留時間。在培養(yǎng)基中培養(yǎng)時，整合在貼片頂部的細(xì)胞在7天內(nèi)存活狀況良好[圖7（e）]。另外，CSC能夠從纖維蛋白凝膠遷移到微針貼片的腔中[圖7（f）]，并分泌再生因子到培養(yǎng)基中，從而證明其具備提高心肌細(xì)胞活力的能力[圖7（g）]。在大鼠MI模型中[圖7（h）]，將含有1 × 106個基質(zhì)細(xì)胞的MN貼片貼在新形成的MI區(qū)[圖7（i）和（j）]，并在MI區(qū)放置7天以上[圖7（k）]。與對照組相比，治療后心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，血管生成密度顯著增加[圖7（j）]，心臟的梗死壁和存活組織較厚[圖7（j）]。治療三周后，接受MN-CSC移植的心臟纖維化程度降低[圖7（l）]。
圖7. 微針陣列貼片遞送心臟基質(zhì)細(xì)胞用于MI治療。（a）細(xì)胞整合的微針貼片的設(shè)計示意圖。（b）微針貼片的代表性圖像，比例尺：500 μm。（c）細(xì)胞整合的微針貼片的熒光圖像，比例尺：500 μm。（d）細(xì)胞活/死染色的代表性圖像，比例尺：200 μm。（e）細(xì)胞存活率的定量分析，n = 3，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。（f）細(xì)胞（綠色）與微針貼片整合3天后的代表性共聚焦圖像。（g）用增殖標(biāo)志物Ki67和α-肉瘤肌動蛋白（α-SA）對新生大鼠心肌細(xì)胞（NRCM）進(jìn)行的定量分析。NRCM單獨培養(yǎng)或在有MN或MN-CSC補(bǔ)丁的情況下培養(yǎng)，n = 3，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。（h）動物研究的整體設(shè)計示意圖。（i）用細(xì)胞貼片處理的心臟的代表性圖像。（j）用細(xì)胞貼片處理的心臟的蘇木精和伊紅（H&E）染色，LV：左心室。（k）用微針貼片處理后7天的心臟的熒光圖像，比例尺：400 μm。（l）使用Masson's三色染色的心肌切片的代表性圖像，心臟是在心肌梗塞三周后獲得的，藍(lán)色表示疤痕組織；紅色表示存活的心肌。
（三）可填充式細(xì)胞儲庫用于MI治療
在另一項研究中，Whyte等制備了一種治療型細(xì)胞儲庫，主要通過干細(xì)胞分泌的旁分泌因子治療心肌梗死。該器械主要由三個部分組成：附著于心臟的細(xì)胞儲庫、植入皮下的通路端口和連接它們的管道。儲庫的可透膜面向心臟表面，而不透膜向外。體外實驗表明，儲存在器械內(nèi)的小鼠間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在培養(yǎng)基中存活28天，并持續(xù)向培養(yǎng)基中釋放熒光素酶。此外，該研究證實，通過填充管道，可向細(xì)胞儲庫補(bǔ)充干細(xì)胞。由于間充質(zhì)干細(xì)胞的生存時間較短，這種多次反復(fù)給藥的策略可以在多個時間尺度上向MI部位遞送細(xì)胞相關(guān)因子，包括細(xì)胞因子、趨化因子和旁分泌因子。
四、大尺寸器械用于CAR-T細(xì)胞療法
CAR-T細(xì)胞療法在治療pre-B型急性淋巴細(xì)胞白血病或B細(xì)胞淋巴瘤方面取得較好的效果，但是應(yīng)用于實體瘤治療時仍面臨多重挑戰(zhàn)。CAR-T細(xì)胞是發(fā)揮抗癌活性的直接功能介質(zhì)，因此在設(shè)計用于實體腫瘤治療的CAR-T細(xì)胞遞送器械時，必須考慮提升CAR-T細(xì)胞停留在腫瘤部位的能力和數(shù)量，并為細(xì)胞提供物理支持，提高CAR-T細(xì)胞的生存能力和抗癌活性。
為了實現(xiàn)上述目標(biāo)，Coon等開發(fā)了用于CAR-T細(xì)胞遞送的鎳鈦合金薄膜（thin-film nitinol, TFN）。薄膜上設(shè)計有微型圖像，允許金屬膜在外力作用下發(fā)生形變，單軸拉伸形變可超過100%。通過將纖維蛋白凝膠層覆蓋在器械表面，可以促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的黏附和遷移。此外，抗CD3、CD28和CD137的抗體亦被結(jié)合到纖維蛋白凝膠上，用以刺激CAR-T細(xì)胞的擴(kuò)增。在體外培養(yǎng)實驗中，TFN上的CAR-T細(xì)胞能夠保持功能達(dá)6天。在不可切除的卵巢癌模型中，通過TFN遞送的CAR-T細(xì)胞能夠根除70%的小鼠腫瘤，延長平均生存時間至80天，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于靜脈注射或瘤內(nèi)注射CAR-T細(xì)胞的小鼠的生存時間。這種方法為增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞對實體瘤的抗腫瘤活性提供了一種選擇。
GFOGER修飾的海藻鈉水凝膠也被用于增強(qiáng)T細(xì)胞在腫瘤部位的增殖和滯留能力，并對切除的4T1腫瘤和多灶性卵巢癌具有顯著的抗癌活性。Weiden等開發(fā)了一種可注射、生物相容、功能化的聚異氰酸多肽水凝膠。當(dāng)T細(xì)胞與其一同注射到腫瘤部位后，該凝膠可改善T細(xì)胞在腫瘤部位的停留時間并持續(xù)釋放出細(xì)胞。此外，將能夠分泌IL-15的CAR-T細(xì)胞與PEG-殼聚糖水凝膠聯(lián)合注射至視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤中，可以顯著提高CAR-T細(xì)胞的抗癌活性，從而保住了小鼠的視力。這些治療策略均取得了令人鼓舞的治療結(jié)果。然而，免疫抑制和低氧的腫瘤微環(huán)境仍可能會阻礙CAR-T細(xì)胞對實體腫瘤的抗癌活性。因此，研究人員又發(fā)展了一些新的策略來解決這些問題。
為了逆轉(zhuǎn)腫瘤免疫抑制微環(huán)境，Hu等設(shè)計了一種可生物降解的HA水凝膠儲庫，用于同時遞送硫酸軟骨素蛋白聚糖4（chondroitin sulfate proteoglycan 4, CSPG4）靶向的CAR-T細(xì)胞、抗程序性細(xì)胞死亡配體1抗體（anti-programmed cell death ligand 1 antibody, aPDL1）修飾的血小板（P-aPDL1）和細(xì)胞因子IL-15包裹的聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid), PLGA]納米顆粒[圖8（a）和（b）]。將水凝膠植入術(shù)后腫瘤部位，局部腫瘤的復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)端腫瘤生長均得到了抑制。水凝膠儲庫能夠持續(xù)緩慢地向周圍腫瘤組織釋放CAR-T細(xì)胞，避免了因細(xì)胞突釋而導(dǎo)致的CAR-T細(xì)胞大量失活。同時，水凝膠中加載的IL-15能夠維持CAR-T細(xì)胞的活性[圖8（a）]。此外，術(shù)后炎癥環(huán)境能夠觸發(fā)血小板活化，加速抗aPDL1的釋放，抑制免疫檢查點通路，增強(qiáng)CAR-T細(xì)胞的殺傷作用。在體外實驗中，血小板能夠在96 h內(nèi)完全地從水凝膠中釋放出來；與之對比，在相同條件下，只有50%的CAR-T細(xì)胞從水凝膠中釋放[圖8（c）]。在共體外培養(yǎng)實驗中，含有P-aPDL1和CAR-T細(xì)胞的水凝膠顯示出較好的抗癌活性[圖8（d）]。在體內(nèi)實驗中，裝載CAR-T細(xì)胞和P-aPDL1的水凝膠儲庫顯示出明顯高于其他組的腫瘤抑制活性[圖8（e）]。值得注意的是，這種水凝膠的全身抗癌活性證實了水凝膠的單側(cè)給藥可以抑制對側(cè)腫瘤的生長[圖8（f）]。
圖8. 一種用于同時遞送和緩慢釋放CAR-T細(xì)胞和偶聯(lián)了a-PDL1的血小板的水凝膠儲庫。（a）水凝膠用于手術(shù)后細(xì)胞免疫療法的機(jī)制示意圖。PMP：血小板衍生的微粒子；NP：納米粒子。（b）裝有細(xì)胞和血小板的水凝膠的典型冷凍掃描電子顯微鏡圖像，比例尺：10 μm。（c）CAR-T細(xì)胞和血小板在體外的釋放，1×107個CAR-T細(xì)胞和1×107個血小板被裝入水凝膠，n = 3。（d）腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞共培養(yǎng)72 h后的細(xì)胞流式圖，n = 3，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。（e）治療三周后小鼠腫瘤的代表性圖像，小鼠接受了以下治療，1：生理鹽水；2：P-aPDL1@gel；3：CAR-T細(xì)胞；4：CAR-T + P-aPDL1；5：CAR-T@gel；6：CAR-T@gel + P-aPDL1；7：CAR-T-P-aPDL1，比例尺：1 cm。（f）右側(cè)原發(fā)腫瘤治療后左側(cè)腫瘤的大小，n = 6，**P = 0.0023，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。
為了改善腫瘤缺氧微環(huán)境，Luo等制備了一種多孔水凝膠包被的免疫芯片系統(tǒng)，用于同時遞送CAR-T細(xì)胞、IL-15和O2到實體腫瘤中。在實體瘤內(nèi)，凝膠層逐漸降解并向腫瘤微環(huán)境釋放氧氣，從而為CAR-T細(xì)胞提供氧氣，促進(jìn)CAR-T細(xì)胞從免疫芯片遷移到腫瘤。該療法能夠增強(qiáng)T細(xì)胞對腫瘤基質(zhì)的浸潤并提高細(xì)胞的存活率，降低腫瘤細(xì)胞HIF-1α和Ki67的表達(dá)，展示出抑制腫瘤生長的能力。
五、3D打印水凝膠以建立血管網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)
實體器官包含相互穿插的血管網(wǎng)絡(luò)，具有物質(zhì)輸送功能?；谏锵嗳菪运z的3D打印血管網(wǎng)絡(luò)對于人工器官（包括復(fù)合血管骨骼、骨骼肌、心臟組織和肝臟）的細(xì)胞生存至關(guān)重要。Cui等采用質(zhì)地較硬的PLA和載細(xì)胞的柔性GelMA分別構(gòu)建骨支架和血管，將局部生物活性因子固定，并結(jié)合3D打印技術(shù)建立具有血管網(wǎng)絡(luò)的骨骼。此外，Zhang等以內(nèi)皮細(xì)胞自促作用為基礎(chǔ)，利用3D打印技術(shù)制備基于水凝膠的含血管心肌組織，將血管形成和血管新生結(jié)合起來。
最近，Grigoryan等開發(fā)了一種3D打印策略，創(chuàng)建具有內(nèi)部纏繞血管網(wǎng)絡(luò)的生物相容性水凝膠，并通過血管內(nèi)3D流體混合器和二尖瓣進(jìn)一步將其功能化。該研究發(fā)現(xiàn)，無毒的食品添加劑檸檬黃可吸收多余光子，從而增強(qiáng)立體投影在z軸的分辨率，使制備具有纏繞血管網(wǎng)絡(luò)的柔性水凝膠成為可能。此外，通過3D打印技術(shù)，在血管網(wǎng)絡(luò)中還進(jìn)一步引入了功能性血管內(nèi)流體混合器和二尖瓣[圖9（a）]，證實這種3D打印技術(shù)能夠產(chǎn)生具有拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的功能性血管。在該研究中，研究人員利用3D打印技術(shù)制備了非連續(xù)的立方晶格和纏繞環(huán)面[圖9（b）和（c）]，并證實血管間存在O2運輸[圖9（d）]。此外，該研究還進(jìn)一步制備了具有類似肺泡拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的水凝膠，用于研究呼吸過程中的氧氣交換過程[圖9（e）]，證實分支的血管網(wǎng)絡(luò)、水凝膠膨脹和血液重定向都能夠?qū)崿F(xiàn)更快的氧氣交換。研究人員還制備了包裹哺乳動物細(xì)胞的可植入水凝膠，驗證了這種打印策略與活細(xì)胞的相容性。該纖維蛋白水凝膠器械中含有肝臟組織聚集物、內(nèi)皮細(xì)胞嵌入的血管腔以及用于固定纖維蛋白凝膠的水凝膠錨栓，被用作肝臟模型進(jìn)行研究[圖9（f）和（g）]。在慢性肝損傷小鼠模型中，該器械能夠在體內(nèi)存活超過14天，并在肝聚集物附近的微血管中發(fā)現(xiàn)了宿主血細(xì)胞。這種用于打印血管網(wǎng)絡(luò)的3D打印技術(shù)，可應(yīng)用于大型3D器械中，促進(jìn)其與機(jī)體的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)的交換。
圖9. 具備精密血管結(jié)構(gòu)功能的3D打印柔性水凝膠。（a）在由20 wt%的聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA；6 kg•mol-1）制成的水凝膠中3D打印出纏繞的軸向血管和螺旋線，比例尺：3 mm。（b）水凝膠內(nèi)的希爾伯特曲線，比例尺：3 mm。（c）環(huán)狀物和環(huán)形結(jié)，比例尺：3 mm。（d）軸向血管和包圍的螺旋，紅細(xì)胞從入口流向出口，比例尺：1 mm。（e）有紅細(xì)胞流動的肺泡狀結(jié)構(gòu)的照片，Deoxy RBCs：脫氧紅細(xì)胞，oxy RBCs：含氧紅細(xì)胞，比例尺：1 mm。（f）裝有肝細(xì)胞聚集物的多室水凝膠構(gòu)造，血管網(wǎng)絡(luò)中播種了內(nèi)皮細(xì)胞。（g）部分水凝膠的共聚焦顯微鏡圖像，Hep：肝細(xì)胞聚集物。
六、討論與結(jié)論
在過去的幾年里，人們用生物相容的惰性材料或可降解材料制備了具有各種結(jié)構(gòu)的大尺寸器械，用于遞送細(xì)胞以治療多種疾?。ū?）。大尺寸器械通常被精心設(shè)計，滿足細(xì)胞對營養(yǎng)、氧氣、細(xì)胞因子和免疫豁免環(huán)境的需求，維持細(xì)胞（無論是異體還是異種細(xì)胞）的生存活性和治療功能。為了達(dá)到這些目標(biāo)，近年來發(fā)展起來的預(yù)血管化策略和構(gòu)建局部免疫抑制環(huán)境的策略，能最大限度地為移植物供給氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)，防止其被宿主免疫系統(tǒng)攻擊，從而提高細(xì)胞的負(fù)載率，減少器械體積，發(fā)揮出器械應(yīng)有的治療功能。同時，這些策略也有助于器械的植入和移除。必須指出的是，用于細(xì)胞治療的大尺寸器械必須根據(jù)每種疾病的具體要求而定制。
表1 具有代表性的細(xì)胞治療器械
Note: size was estimated from the image of the device provided in these References. PCL: polycaprolactone; PTFE: polytetrafluoroethylene; CP: cell pouch; HA: hyaluronic acid; PPG: polypropylene glycol; PVA: polyvinyl alcohol; 3D: three-dimensional; HUVEC: human umbilical vein endothelial cell; MSC: mesenchymal stem cell; GelMA: gelatin methacrylate.
治療T1D的大尺寸器械在植入期間必須將功能性細(xì)胞限制在裝置內(nèi)部，并保證胰島素能夠足量釋放至器械外，以調(diào)節(jié)血糖水平。然而，將胰島素分泌細(xì)胞的存活和功能維持足夠長的時間甚至終生仍具有極高的挑戰(zhàn)性。使用生物相容性和免疫相容性材料在減少異物反應(yīng)和纖維化方面已經(jīng)取得了一些成功。這些策略對于器械和機(jī)體微環(huán)境間物質(zhì)的順利交換以維持器械內(nèi)部封裝的細(xì)胞的功能和活性來說至關(guān)重要。此外，降低纖維化也避免了裝置與周圍組織的黏附，方便器械失效后能夠被移出體外。目前，胰島或β細(xì)胞植入器械的研究重點仍集中在優(yōu)化腔體器械膜的理化特性，以減少纖維化并促進(jìn)新生血管再生。
近年來，隨著多能干細(xì)胞來源的胰島素分泌細(xì)胞的相關(guān)研究逐漸成熟，異體胰島供應(yīng)短缺的問題得到了一定程度的解決。提高分化細(xì)胞在移植期間的存活率可能有利于疾病的治療。相比于胰島，多能干細(xì)胞來源的治療性細(xì)胞可能潛在的易誘發(fā)全身性疾病或癌癥。因此，基于這些細(xì)胞的大尺寸器械必須被設(shè)計得足夠堅固和耐用。另外，植入的位置需要仔細(xì)選擇，以減少碰撞和器械破裂導(dǎo)致其失效的可能性。另外，減少免疫反應(yīng)對細(xì)胞生存至關(guān)重要，需要更多的研究來證實免疫系統(tǒng)對植入細(xì)胞在周期超過一年時的影響。此外，與凝膠相比，腔室型器械具有更高的強(qiáng)度，可能更適合于干細(xì)胞移植。
雖然通過干細(xì)胞誘導(dǎo)生成胰島細(xì)胞能夠緩解胰島供應(yīng)短缺的問題，但是如何將大量細(xì)胞植入尺寸可接受的器械是另一個難點。據(jù)估計，要使受試者恢復(fù)正常血糖水平，需要30萬個當(dāng)量的胰島。然而，膜控釋系統(tǒng)與生理環(huán)境之間緩慢的養(yǎng)分和氧氣交換要求容器的厚度小于300 µm。此外，體內(nèi)可供負(fù)載了細(xì)胞的器械植入的空間有限。如何提高臨床相關(guān)的密閉擴(kuò)散室中的功能細(xì)胞的密度，同時保持其生存活性和治療功能，仍然是一個挑戰(zhàn)。將2D結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為3D結(jié)構(gòu)或通過外部裝置提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣（如“β-Air”裝置）是解決這一問題的一種可行選擇。此外，利用3D打印技術(shù)，在植入物內(nèi)部構(gòu)建血管網(wǎng)絡(luò)或空氣網(wǎng)絡(luò)可能有助于解決這一問題。
在未來，裝載胰島素分泌細(xì)胞的大尺寸器械可能會成為一種“現(xiàn)成”的產(chǎn)品，用于治療內(nèi)源性胰島素分泌不足的患者。大尺寸器械可通過微創(chuàng)手術(shù)植入。干細(xì)胞來源的治療細(xì)胞作為另一種“現(xiàn)成”產(chǎn)品，通過器械上的外接端口，可反復(fù)填充至已植入的器械中，增強(qiáng)其治療作用。此外，聯(lián)合使用胰島素分泌細(xì)胞和胰高血糖素分泌細(xì)胞的大尺寸器械，或能改善血糖控制。
在眾多基于干細(xì)胞的MI療法中，為了延長細(xì)胞治療時間，其中一種療法是將裝載了細(xì)胞的器械植入到心臟表面，并經(jīng)一個管道多次充填細(xì)胞到器械中。充足的營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣供應(yīng)是延長細(xì)胞生存時間的另一種選擇，且可以避免復(fù)雜的細(xì)胞填充過程。如果裝置是可生物降解的，則不需要移除植入的細(xì)胞和器械，可以避免因器械移除而造成的二次創(chuàng)傷，增強(qiáng)患者的依從性。另外，心臟在不停地跳動，因此如何將器械安裝到心臟表面并固定是一項很有挑戰(zhàn)性的工作。因此，為了滿足MI的治療要求，用于治療MI的器械需要具有靈活性、黏性、耐用性和生物相容性。在未來，MI治療器械將能夠同時提供監(jiān)測和細(xì)胞遞送功能。對治療MI的細(xì)胞可根據(jù)病情的發(fā)展進(jìn)行類型和數(shù)量的調(diào)整。
CAR-T細(xì)胞免疫治療中，器械設(shè)計的重點已經(jīng)從提供物理支持轉(zhuǎn)變?yōu)閷⑨尫诺侥[瘤中的CAR-T細(xì)胞或基因工程T細(xì)胞的治療功能最大化。此類器械一般植入到腫瘤部位，直接對病灶部位進(jìn)行細(xì)胞遞送。再通過生物活性分子修飾器械，刺激CAR-T細(xì)胞增殖，增強(qiáng)對腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。例如，PLGA納米顆粒中包裹的IL-15可以顯著促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的增殖和存活，從而增強(qiáng)器械的抗實體瘤活性。未來，開發(fā)出將細(xì)胞釋放裝置植入內(nèi)部器官腫瘤（而不是皮膚和眼睛等淺表器官）的策略，將進(jìn)一步擴(kuò)大這種裝置的臨床應(yīng)用。
本文選自中國工程院院刊《Engineering》2022年第6期
作者：劉薇, 王延芳, 王金強(qiáng), Olivia L. Lanier, Marissa E. Wechsler, Nicholas A. Peppas, 顧臻
來源：Macroencapsulation Devices for Cell Therapy[J].Engineering,2022,13(6):53-70
京公網(wǎng)安備11010802046783號
