近期，東華大學(xué)王璐教授和上海交通大學(xué)附屬第九人民醫(yī)院副主任醫(yī)師王一惟、達(dá)駿在科愛出版創(chuàng)辦的期刊 Bioactive Materials 上聯(lián)合發(fā)表研究文章：用于定制化醫(yī)療的納米纖維生物膠帶及輸尿管支架管。根據(jù)定制化醫(yī)療的需求，開發(fā)了一種自粘性的厚度為微米級(jí)的超薄納米纖維膠帶（Nanofiber Bio-tape, NFBT），創(chuàng)建了針對(duì)定制化醫(yī)療的術(shù)中載藥策略及基于“支架管-藥物-納米纖維膠帶”的多重緩釋結(jié)構(gòu)的輸尿管支架管的模塊化載藥系統(tǒng)。
研究內(nèi)容簡介
局部給藥可以保持藥物的原始分子結(jié)構(gòu)，支持直接和精確地使用目標(biāo)藥物。在下尿路系統(tǒng)，可通過導(dǎo)尿管將藥物灌入膀胱來實(shí)現(xiàn)局部給藥。但由于尿液的定向傳輸特性，藥物難以抵達(dá)上尿路系統(tǒng)。因此，在輸尿管支架管表面構(gòu)建可控的藥物緩釋系統(tǒng)是術(shù)后泌尿系統(tǒng)治療的直接方案。除了局部用藥的要求外，“一刀切”的用藥方案也不適用于復(fù)雜的泌尿系統(tǒng)疾病。因此，亟須提出一種定制化的載藥方案，支持外科醫(yī)生在手術(shù)過程中根據(jù)手術(shù)視野和具體的臨床適應(yīng)癥來決定藥物的種類和劑量。這就要求藥物負(fù)載應(yīng)在術(shù)中進(jìn)行，即在聚合物成型之后和支架管植入之前。然而，目前的藥物輸送系統(tǒng)不能同時(shí)滿足泌尿系統(tǒng)原位給藥和定制化治療的要求。傳統(tǒng)載藥植入物的制備方法是將藥物和高聚物同時(shí)溶解于有機(jī)溶劑中，去除溶劑后將藥物截留在高聚物基質(zhì)中。在釋放過程中，水溶液可以滲入聚合物的孔隙緩慢溶解藥物，或隨著聚合物的降解逐漸暴露出藥物。藥物載體的制備技術(shù)包括3D打印、溶劑澆鑄和微納米膠囊等。所載藥物的類型和劑量通常在聚合物成型時(shí)既已確定，在使用中無法調(diào)整。本章根據(jù)定制化醫(yī)療的需求，開發(fā)了一種自粘性的微米級(jí)超薄納米纖維膠帶（Nanofiber Bio-tape, NFBT），創(chuàng)建了針對(duì)定制化醫(yī)療的輸尿管支架管的模塊化載藥系統(tǒng)及“支架管-藥物-納米纖維膠帶”的多重緩釋結(jié)構(gòu)。然后，探究納米纖維膠帶與支架管的結(jié)合牢度，藥物遞送性能及釋藥機(jī)制，對(duì)材料的生物相容性進(jìn)行評(píng)估。構(gòu)建雌性白豬UTI模型，探究了納米纖維膠帶載藥模塊的體內(nèi)釋藥效果和治療效果，并對(duì)其組織相容性、生物膜及結(jié)殼情況進(jìn)行了對(duì)照分析。
一. NFBT 納米纖維膠帶的構(gòu)建
靜電紡絲納米纖維生物膠帶（NFBT）可在靜電力作用下粘附于聚氨酯支架管表面，在一定壓力下卷繞，NFBT與支架管緊密結(jié)合，結(jié)合牢度高于NFBT本身的拉伸強(qiáng)力。
圖1. NFBT的形態(tài)和機(jī)械行為：(A)NFBT和US的加載策略示意圖；(B)NFBT潤濕前的SEM圖像；(C)NFBT潤濕后的SEM圖像；(D)NFBT的應(yīng)力-應(yīng)變曲線；(E)NFBT在拉伸試驗(yàn)中的行為；(F)和(G)NFBT的結(jié)合強(qiáng)度
二. 體外載藥及緩釋結(jié)果
呋喃妥因（NFT）是一種典型的親脂性藥物，羅丹明B（RB）是水溶性的模型藥物，兩種藥物負(fù)載量分別為150mg時(shí)。NFBT-NFT在28天內(nèi)表現(xiàn)出恒定的藥物釋放，與零階藥物釋放動(dòng)力學(xué)一致（Mt/M∞=1.04236t，R2=0.9929；圖2（A）和（B））。藥物釋放72小時(shí)后，NFBT層之間的NFT結(jié)晶粉末保持均勻分布（圖2（D））。圖2(E)-(G)顯示，NFBT-RB的釋放行為明顯不同。在最初的24小時(shí)內(nèi)，超過80%的RB被釋放，之后藥物的釋放速度減慢。在第三天，NFBT仍然保持著分層結(jié)構(gòu)，而在橫斷面樣品中很少觀察到RB晶體。
圖2. NFBT-NFT和NFBT-RB的藥物釋放特性。(A)和(B)NFBT-NFT的長期和短期藥物釋放曲線；(C)NFBT-NFT在體外藥物釋放7、21、28天前后的圖像；(D)NFBT-NFT在第一天和第三天的SEM圖像。(E)和(F)NFBT-RB的長期和短期藥物釋放曲線；(G)NFBT-RB在體外釋放1小時(shí)、1天和7天后的圖像；(H)NFBT-NFT在第一天和第三天的SEM圖像。
三. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)
采用典型的輸尿管鏡手術(shù)經(jīng)尿道將NFBT-CTL或NFBT-NFT裝載的NFT（150mg）植入豬的左輸尿管中。監(jiān)測尿液中NFT的含量。圖3（B）顯示，NFT的濃度在植入后4小時(shí)（28.7±10.4微克/毫升）和24小時(shí)（9.4±2.3微克/毫升）之間迅速下降，此后緩慢下降到第28天的1.6±0.5微克/毫升。通過瓊脂平板計(jì)數(shù)法定期測定從植入的動(dòng)物身上收集的尿液中的CFU數(shù)量。圖4(C)和(D)顯示，NFBT-CTL組的CFU計(jì)數(shù)在4小時(shí)內(nèi)超過1×105/mL，到第28天時(shí)數(shù)值增加到1~2×106 CFU/mL。相比之下，NFBT-NFT組顯示出明顯的殺菌效果，直到第28天尿液中都沒有檢測到細(xì)菌。NFBT給藥的NFT總量只有150毫克，約為臨床口服劑量的2.68wt%。因此，在尿液中測得的藥物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于口服量，可以得出結(jié)論，原位給藥系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了更高的藥物利用率。
圖3：NFBT-NFT組和NFBT-CTL組尿液分析：（A）植入方法示意圖；（B）檢測到的豬尿中NFT含量；（C和D）通過瓊脂平板計(jì)數(shù)測量的尿液中細(xì)菌濃度。***p < 0.001
植入聚氨酯支架管后的生物膜的形成和結(jié)殼被廣泛報(bào)道，常常導(dǎo)致尿路感染。在植入28天后取出支架樣品，確定表面生物膜的形成和結(jié)殼的程度。
圖4（A）顯示了從兩個(gè)植入組（NFBT-CTL和NFBT-NFT）的支架管部分和NFBT獲得的CFU計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，NFBT-NFT的 CFU減少99%。在兩組中，NFBT上的粘附細(xì)菌都明顯少于支架部分。圖4(C)中NFBT-CTL的SEM圖像顯示，在支架部件的表面有大約1.6μm厚的殼狀結(jié)構(gòu)。在這些結(jié)構(gòu)中，可以觀察到聚集的細(xì)菌，表明該殼是由有機(jī)物、無機(jī)物和細(xì)菌組成的復(fù)合層。在NFBT組件上也觀察到類似的結(jié)果。雖然納米纖維表面沒有殼狀結(jié)構(gòu)，但可觀察到細(xì)菌的廣泛分布。而NFBT-NFT組的生物膜形成和結(jié)殼現(xiàn)象明顯減少（圖4（D））。支架上殼狀結(jié)構(gòu)的厚度（0.29微米）比NFBT-CTL組的要少80%，細(xì)菌的數(shù)量也顯著減少。這些結(jié)果表明，NFT的釋放可以抵御細(xì)菌的附著，從而防止支架上大規(guī)模生物膜的形成和結(jié)殼。
圖4. 支架各部分的體內(nèi)生物膜的形成和結(jié)殼情況。(A) CFU細(xì)菌計(jì)數(shù)；(B) 表面元素分析；(C) NFBT-CTL的SEM圖像和EDS分析；(D) NFBT-NFT的SEM圖像和EDS分析。*P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001
為了評(píng)估NFBT或NFT可能引起的系統(tǒng)性毒性，在植入動(dòng)物的血樣中監(jiān)測了肝功能的關(guān)鍵生物標(biāo)志物（圖5）。與初始值相比，肝功能的生物標(biāo)志物（即ALT、ALT/AST、γ-GT和TBA）在整個(gè)觀察期沒有顯示出明顯的增加。ALT和ALT/AST表現(xiàn)出一些波動(dòng)，兩組在第7天和第21天表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。然而，這些數(shù)值沒有超過最初的范圍，此后兩條曲線趨于一致，表明對(duì)肝臟的基本功能沒有重大影響。這些觀察結(jié)果也與輸尿管切片的組織學(xué)檢查一致（圖6（C））。肝細(xì)胞表現(xiàn)出正常的形態(tài)，沒有觀察到明顯的壞死、增生或淋巴細(xì)胞浸潤。
兩組的血液學(xué)分析也顯示對(duì)生理指標(biāo)（即WBC和LYM，圖5）沒有明顯的不利影響。然而，在第7天和第14天，NFBT-CTL組的WBC和LYM水平明顯較高（與初始值或NFBT-NFT組相比），表明細(xì)菌入侵誘發(fā)了種植體周圍感染。相比之下，NFBT-NFT組的這兩個(gè)指標(biāo)保持穩(wěn)定，表明NFT的持續(xù)釋放可以抑制細(xì)菌感染。
圖5. 植入期間試驗(yàn)動(dòng)物血液主要指標(biāo)。NFBT-NFT組和NFBT-CTL組之間的顯著差異用*（P<0.05），**（P<0.01）標(biāo)記，與第0天相比，顯著差異用#（P<0.05），##（P<0.01）標(biāo)記。
兩個(gè)留置支架（NFBT-NFT和NFBT-CTL）的輸尿管都有擴(kuò)張和迂曲現(xiàn)象。植入28天后，NFBT仍然固定在支架的上部。圖6(C)顯示，兩組患者的左輸尿管過渡上皮都出現(xiàn)了一些腫脹（在HE染色的切片上顯示）。這在NFBT-CTL組更為明顯，上皮組織腫脹到50.67±11.5米的厚度，內(nèi)部觀察到剝落的囊泡組織。對(duì)CD 3和CD 68染色組織的檢查顯示，NFBT-NFT組的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤低于NFBT-CTL組（圖6（C））。由于兩組與左輸尿管這一區(qū)域接觸的材料都是聚氨酯，所以植入物引起的免疫排斥反應(yīng)應(yīng)該是一樣的。炎癥反應(yīng)的差異可歸因于支架表面不同程度的感染、生物膜和結(jié)殼。還對(duì)直接與NFBT接觸的左輸尿管的上部進(jìn)行了染色和觀察，以研究NFBT和NFT的組織相容性。圖7（D和F）顯示，兩組的結(jié)果與PUUS部分相似，NFBT-NFT組的上皮組織厚度為（35.6±7.8）μm，NFBT- CTL為（53.3±12.1）μm。這表明NFBT的組織相容性與PUUS一樣，局部高濃度NFT對(duì)組織的額外刺激和損傷可以忽略不計(jì)。對(duì)上皮組織厚度的整體分析見圖6(G)，發(fā)現(xiàn)NFBT-NFT組明顯抑制了炎癥程度，證明了NFBT作為局部給藥系統(tǒng)的治療效率。此外，與NFBT-NFT相比，NFBT-CTL的左腎出現(xiàn)了腎小管的腫脹和擴(kuò)張。NFBT-CTL的膀胱上皮組織也顯示出較高水平的水腫、氣球變性和炎癥細(xì)胞浸潤（圖6（D和F））。對(duì)右腎和輸尿管也進(jìn)行了檢查，在NFBT-NFT組也觀察到炎癥水平降低（圖6（D））。由于這些組織沒有直接與植入的支架接觸，可以排除排異反應(yīng)，兩組之間的差異應(yīng)該是由感染性因子誘發(fā)的炎癥造成的。因此，組織染色結(jié)果表明，NFT的持續(xù)釋放可以通過減少細(xì)菌入侵的程度來緩解整個(gè)泌尿系統(tǒng)的感染。
圖6. 泌尿系統(tǒng)的組織學(xué)檢查：(A)和(B)腎臟和尿路的一般觀察；(B-E)植入后28天的代表性HE、CD3和CD68染色切片(比例尺，100μm)；(F)輸尿管和膀胱上皮組織厚度的統(tǒng)計(jì)分析；(G)NFBT-NFT和NFBT-CTL組上皮組織厚度的顯著性分析。
四、結(jié)論
本研究制備了一種超薄的NFBT，并評(píng)估了其作為輸尿管支架管的自粘性藥物輸送系統(tǒng)的釋藥行為和相容性。NFBT的多屏障結(jié)構(gòu)延長了藥物的釋放時(shí)間，親水性藥物RB可維持 7天的持續(xù)釋放，疏水性藥物NFT顯示出28天的零級(jí)釋放。使用豬尿路感染模型進(jìn)行的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，NFBT具有良好的生物相容性、粘合性和持續(xù)的藥物釋放行為。由于NFT在泌尿系統(tǒng)中的持續(xù)釋放，尿路感染、生物膜形成和結(jié)殼的程度得到了明顯改善。
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