鹽酸替羅非班氯化鈉注射液是一種可用于預(yù)防早期心肌梗死的藥品——其主要有效成分替羅非班存在兩種構(gòu)型，即S構(gòu)型和R構(gòu)型，其中只有S-替羅非班才具有治療效果，對于R-替羅非班則需要將其作為雜質(zhì)進行控制。本文建立了一種用正相液相色譜法測定R-替羅非班含量的方法，并對其專屬性、檢測限、定量限等指標(biāo)進行了驗證，證明了該方法的準(zhǔn)確性及可靠性。
鹽酸替羅非班氯化鈉注射液用于治療在末次胸痛發(fā)作12h之內(nèi)且伴有心電圖（ECG）改變和/或心肌酶升高的非ST段抬高型急性冠脈綜合癥（NSTE-ACS）成年患者，以預(yù)防早期心肌梗死。
目前已有國內(nèi)外研究證明：鹽酸替羅非班可有效改善AMI患者急診PCI后的心功能，減輕心肌損傷，提高微血管灌注，且安全性較高[1]，用于急性心肌梗死患者的治療能取得較好的效果；此外，該藥品還可促使患者的心肌微循環(huán)恢復(fù)正常，有效改善血漿纖溶因子與凝血因子水平，減少內(nèi)皮細胞凋亡數(shù)，因此非常值得臨床應(yīng)用[2]。很多其他藥物與鹽酸替羅非班聯(lián)合使用也均可獲得優(yōu)于單一用藥的良好臨床療效，其他藥物包括阿司匹林[3]、黃芪桂枝五物湯[4]、氯吡格雷[5]、肌氨肽苷[6]、補陽還伍湯[7]、低分子肝素[8]、清熱活血湯[9]等。
鹽酸替羅非班氯化鈉注射液中的有效成分替羅非班具有手性碳原子，在合成過程中會存在兩種構(gòu)型，即S構(gòu)型和R構(gòu)型，其中只有S-替羅非班才具有治療效果，R-替羅非班則為雜質(zhì)，需要對其進行控制。一般采用正相色譜法檢驗鹽酸替羅非班原料藥中的R-替羅非班，但該方法中不能含有水相，無法適用于鹽酸替羅非班氯化鈉注射液。過往文獻中有部分研究人員采用反向色譜法測量R-替羅非班的含量，但測試結(jié)果顯示R-替羅非班與主藥S-替羅非班分離度達不到要求，靈敏度低，且基線干擾大，方法適用性差，且通過方法優(yōu)化后，分離度也無明顯改善。
本文采用正相液相色譜法對R-替羅非班進行檢測，通過使用固相萃取小柱除去了鹽酸替羅非班氯化鈉注射液中的水相，并對R-替羅非班進行了富集，從而提高了檢測的靈敏度。
1、實驗材料
1.1?儀器設(shè)備
高效液相色譜儀（Agilent 1260，安捷倫），電子天平（MSA6.6S-OCE-DM，賽多利斯），色譜柱（CHIRACPAK® IC，大賽璐），固相萃取小柱等。
1.2?試劑試液
R-替羅非班對照品（批號1861-098A1，TLC），正己烷（批號19130917G905，n-Hexane），異丙醇（批號TAVGIH，霍尼韋爾），甲醇（批號WXBD1024V，Sigma），乙二胺（批號201912053，湖南匯虹試劑），三氟乙酸（批號C10919649，國藥集團），鹽酸替羅非班氯化鈉注射液（批號K20030201S，湖南科倫制藥），氯化鈉（批號180810，河北華晨藥業(yè)）。
2、實驗方法
2.1?溶液的配制
配制對照品貯備液：精密稱取R-替羅非班對照品2.5?mg，置50?ml量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。
配制對照品溶液：精密量取對照品貯備液1?ml，置100?ml量瓶中，加流動相稀釋至刻度，搖勻。
配制供試品溶液：取鹽酸替羅非班氯化鈉注射液50?ml，通過已活化（用5?ml甲醇和5?ml超純水依次沖洗）的C18固相萃取小柱，待溶液滴盡后，用約10 ml的水沖洗，然后棄去水洗液，加甲醇5?ml洗脫至10?ml量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻。
配制系統(tǒng)適用性溶液：精密量取鹽酸替羅非班氯化鈉注射液50?ml，加入對照品貯備液1?ml，照供試品溶液進行制備。
配制輔料空白溶液：稱取氯化鈉4.50?g，加水500?ml溶解，量取50?ml，照供試品溶液進行制備。
2.2?分析方法
色譜柱采用纖維素-三（3，5-二氯苯基氨基甲酸酯）鍵合硅膠為填充劑（CHIRALPAK IC，條件為4.6?mm×250?mm，5?μm）；以正己烷-異丙醇-甲醇-乙二胺-三氟乙酸（400∶400∶300∶3∶3）為流動相；紫外檢測器，檢測波長為227?nm；流速為1.0?ml/min，進樣量20?μl。
3、實驗結(jié)果
3.1?方法的專屬性
（1）配制溶液
配制酸降解溶液：取鹽酸替羅非班氯化鈉注射液50?ml，加入2?mol/l HCl 1?ml，室溫放置24h，加入2?mol/LNaOH 1?ml中和后，照供試品溶液進行制備。
配制堿降解溶液：取鹽酸替羅非班氯化鈉注射液50?ml，加入2?mol/l NaOH 1?ml，室溫放置24h，加入2?mol/l??HCl?1?ml中和后，照供試品溶液進行制備。
配制氧化降解溶液：取鹽酸替羅非班氯化鈉注射液50?ml，加入3%? H2O2 ?1?ml，室溫放置24h，照供試品溶液進行制備。
配制高溫降解溶液：取鹽酸替羅非班氯化鈉注射液于120℃加熱4?h，精密量取50?ml，照供試品溶液進行制備。
配制光降解溶液：取本品在5000?LX光照箱中放置10天；精密量取光照樣品50?ml，照供試品溶液進行制備。
不同溶液的檢測結(jié)果
（a）酸降解溶液
（b）堿降解溶液
（c）氧化降解溶液
（d）高溫降解溶液
（2）測定結(jié)果
測定的典型圖譜如圖1、圖2所示，可以看出，陰性空白溶液不干擾R-替羅非班的檢驗，系統(tǒng)適用性溶液中R-替羅非班與S-替羅非班分離度良好，酸、堿、氧化和高溫降解溶液中R-替羅非班與相鄰峰之間的分離度也符合要求。
圖1 陰性空白溶液檢測結(jié)果
圖2 系統(tǒng)適用性溶液檢測結(jié)果
3.2?檢測限與定量限
取2.1中的對照品貯備液適量，逐級稀釋，以3∶1信噪比對應(yīng)的濃度作為檢測限，以10∶1信噪比對應(yīng)的濃度作為定量限。結(jié)果R-替羅非班的檢測限為0.0474?μg/ml，定量限為0.0948?μg/ml，這表明方法的靈敏度符合要求。
3.3?線性關(guān)系考察
取2.1中的對照品貯備液適量，用流動相將其濃度稀釋為0.0948?μg/ml～0.9483?μg/ml的線性溶液，按照2.2中的方法進行測定。對于測定結(jié)果，以濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進行線性回歸。結(jié)果可得線性方程y= 29295.8077x－361.9512，相關(guān)系數(shù)r為0.9995，Y軸截距為100%響應(yīng)值的2.68%，這表明該方法的線性關(guān)系良好。
3.4?重復(fù)性試驗
取同批次的鹽酸替羅非班氯化鈉注射液6份，每份精密量取50?ml，分別加入2.1中的對照品貯備液1?ml，混勻。然后，使其通過固相萃取小柱，并棄去水溶液，用甲醇5?ml洗脫至10?ml量瓶，用流動相定容至刻度。結(jié)果6份供試品溶液中R-替羅非班的平均含量為0.24%，RSD為1.18%（n=6），這表明方法的重復(fù)性良好。
3.5?準(zhǔn)確度試驗
精密量取2.1中的對照貯備液0.5?ml、1.0?ml、1.5?ml各3份，分別置于50?ml量瓶中，用鹽酸替羅非班氯化鈉注射液稀釋至刻度，搖勻，配制回收率溶液測定。計算回收率，結(jié)果見表1，可以看到平均加樣回收率為104.6%，RSD為1.10%（n=6）），這表明實驗的準(zhǔn)確性良好。
表1 準(zhǔn)確度驗證結(jié)果匯總
3.6?溶液穩(wěn)定性考察
取2.1中的對照品溶液和供試品溶液于室溫條件下放置，分別于實驗開始后的0?h、5?h、10?h及24?h取樣，按照2.2中的方法進行測定。結(jié)果表明對照品溶液和供試品溶液在室溫放置24?h的過程中，峰面積的變化率均在10%以內(nèi)，溶液的穩(wěn)定性良好。
3.7?耐用性考察
考察試驗條件下變化對結(jié)果的影響，檢測波長為227?nm±3?nm，柱溫為30℃±5℃，流速為1.0?ml/min±0.2?ml/min，流動相比例±50，甲醇洗脫量為5?ml±1?ml。結(jié)果R-替羅非班的平均檢出含量為0.25%，RSD為4.72%（n=14），這表明方法的耐用性良好。
3.8?樣品含量的測定
取三批鹽酸替羅非班氯化鈉注射液，用它們依次制備2.1中的供試品溶液，按照2.2中的方法進樣檢測，按外標(biāo)法以峰面積計算。結(jié)果三批樣品中R-替羅非班的含量均在0.2%以內(nèi)。
4、結(jié)論
本文建立了一種測定鹽酸替羅非班氯化鈉注射液中R-替羅非班含量的新方法，通過固相萃取小柱除去了注射液中的水相，使得正向色譜法得以應(yīng)用；并對R-替羅非班進行了富集，提高了檢測的靈敏度。經(jīng)實驗驗證，該方法的專屬性、檢測限、定量限、線性關(guān)系、重復(fù)性、準(zhǔn)確度、溶液穩(wěn)定性和耐用性等指標(biāo)均符合要求，適用于鹽酸替羅非班氯化鈉注射液中R-替羅非班檢查。
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