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導(dǎo) 讀

 

本文將針對(duì)肝衰竭的不同治療手段，包括目前常用的非生物型人工肝和肝移植，以及未來具有治療前景的生物型人工肝進(jìn)行介紹。本篇帶大家了解肝衰竭未來具有應(yīng)用前景的治療手段—生物型人工肝目前的技術(shù)難點(diǎn)。

 

生物型人工肝

 

生物型人工肝（Bio-artificial Liver，BAL）：一種體外肝功能支持系統(tǒng)。

基本原理：將患者血漿通過體外循環(huán)與生物反應(yīng)器中的人肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，短時(shí)間替代肝臟工作，并分泌促肝細(xì)胞生長活性物質(zhì)，促進(jìn)受損肝臟再生修復(fù)，性能上更接近人體肝細(xì)胞，具有解毒、合成、分泌和轉(zhuǎn)化生物活性物質(zhì)的功能（如圖所示）。是今后人工肝發(fā)展的方向，但目前尚處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)或臨床試驗(yàn)階段。

 

 

圖 人工肝圖示1

 

生物型人工肝從研發(fā)到入市面臨著諸多的問題，在技術(shù)上面臨/需要克服的問題主要有兩大類：一是理想的細(xì)胞來源，二是適合細(xì)胞生存以及代謝的生物反應(yīng)器；在入市上存在的問題涉及申報(bào)定性、上市路徑探索、細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)化及質(zhì)量控制、細(xì)胞培養(yǎng)成本高、產(chǎn)品價(jià)格等，下面就技術(shù)上的這些問題進(jìn)行詳細(xì)的介紹。

 

（一）細(xì)胞來源

理想的肝細(xì)胞源要求具有完整的肝功能、良好的增殖能力以及無致瘤、無感染的風(fēng)險(xiǎn)。肝細(xì)胞功能的好壞直接關(guān)系到生物人工肝的性能，目前常用的肝細(xì)胞源有原代人肝細(xì)胞、原代豬肝細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞系HepG2、HepaRG、永生化細(xì)胞以及干細(xì)胞等2。

 

1、原代人肝細(xì)胞

原代人肝細(xì)胞是最理想的細(xì)胞來源。MELS采用原代人肝細(xì)胞，已經(jīng)取得了良好的臨床治療效果。然而用于分離原代肝細(xì)胞肝源稀缺且細(xì)胞的產(chǎn)量和活力都比較低，在體外增殖能力有限且容易喪失肝功能。

 

目前通過改善細(xì)胞培養(yǎng)基成分、增加細(xì)胞外基質(zhì)、采用修飾生物材料、三維培養(yǎng)3以及肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)等方法維持肝細(xì)胞的表型并改善肝功能。在這些方法中肝細(xì)胞與非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的共培養(yǎng)對(duì)于保持原代人肝細(xì)胞的功能是非常重要的。共培養(yǎng)的非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞包括人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮血管結(jié)構(gòu)、以及骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞等。改良聚醚－聚氨酯膜的生物修飾支架可以增強(qiáng)原代人肝細(xì)胞的功能并維持較長的時(shí)間。這些結(jié)果表明改造過的生物支架是生物人工肝潛在的應(yīng)用材料。

 

2、原代豬肝細(xì)胞

由于易獲得性和高功能活性，原代豬肝細(xì)胞是最常用于生物人工肝的細(xì)胞之一。原代豬肝細(xì)胞的BAL的臨床隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證明其在急性肝衰竭的患者中是安全和有效的4。Scott L.Nyberg等將豬肝細(xì)胞培養(yǎng)成肝細(xì)胞懸浮球用于生物人工肝，并延長了急性肝衰竭豬的生存期。然而，豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒（PERV）具有豬傳人異種動(dòng)物性感染的潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前沒有證據(jù)表明其在人體內(nèi)產(chǎn)生異種感染，長期免疫抑制患者在接受載有豬肝細(xì)胞的生物反應(yīng)器治療，8年的隨訪中沒有發(fā)現(xiàn)PERV感染。然而，PERV可以轉(zhuǎn)移到生物反應(yīng)器的濾過膜，并且豬肝細(xì)胞上清液與人細(xì)胞可以短期直接接觸，PERV仍具有感染人細(xì)胞的風(fēng)險(xiǎn)。由于跨物種的免疫反應(yīng)和潛在的異種動(dòng)物病毒的感染限制原代豬肝細(xì)胞在生物反應(yīng)器中的應(yīng)用，歐洲幾個(gè)國家禁止使用原代豬肝細(xì)胞用于生物人工肝。

 

3、肝癌細(xì)胞系HepG2、HepaRG

HepG2因其容易獲得且分泌人蛋白質(zhì)的特點(diǎn)最常用于生物人工肝。肝腫瘤衍生的細(xì)胞系C3A，HepG2的亞克隆，已經(jīng)被ELAD系統(tǒng)用于臨床試驗(yàn)。將C3A細(xì)胞應(yīng)用為ELAD系統(tǒng)的細(xì)胞部分，在一系列的臨床對(duì)照試驗(yàn)后，取得了一定的臨床治療效果，但是生存率沒有明顯改善。藻酸鹽微囊培養(yǎng)C3A細(xì)胞能夠有效地改善白蛋白合成，并且容易形成正常肝細(xì)胞特征的微絨毛狀結(jié)構(gòu)，從而提高治療效果5。

 

HepaRG細(xì)胞系是人雙能肝祖細(xì)胞系，在有或沒有DMSO的條件下可以高密度分化成肝細(xì)胞簇，因此HepaRG細(xì)胞非常適合生物人工肝的應(yīng)用。

 

4、永生化人肝細(xì)胞

為了解決原代肝細(xì)胞體外培養(yǎng)容易失去肝功能并不能長期增殖的問題，研究者們通過猿猴病毒40大抗原基因（SV40LT）或人端粒逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)導(dǎo)開發(fā)了永生化肝細(xì)胞。為了避免SV40LT致瘤的風(fēng)險(xiǎn)，研究人員使用酶特異性重組敲除可逆永生化人肝細(xì)胞中的靶向SV40LT基因，建立可逆永生化細(xì)胞系6。永生化人肝細(xì)胞與人星狀細(xì)胞共培養(yǎng)，或用微囊化大規(guī)模培養(yǎng)，以改善永生化人肝細(xì)胞的分化等級(jí)和功能，這些細(xì)胞可以作為生物人工肝的選擇。

 

5、干細(xì)胞

生物人工肝的肝細(xì)胞源的問題，研究者把目光轉(zhuǎn)向了干細(xì)胞（stem cell），人胚胎干細(xì)胞（hESCs）、誘導(dǎo)多能肝細(xì)胞（iPSCs）和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hMSCs）等干細(xì)胞可以誘導(dǎo)分化為功能性肝細(xì)胞。

hESCs從人受精胚胎囊胚的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來，具有強(qiáng)大的自我更新和多功能分化的潛能；hESCs具有產(chǎn)生功能性肝細(xì)胞的潛能，可以作為細(xì)胞替代療法和肝細(xì)胞移植的肝細(xì)胞源。3D共培養(yǎng)系統(tǒng)中膠原支架和超纖維納米纖維可以促進(jìn)hESCs的肝細(xì)胞分化。結(jié)合組織工程的hESCs與3D共培養(yǎng)系統(tǒng)可以提供功能性肝細(xì)胞的來源，能夠潛在用于新型生物人工肝。

 

iPSCs被定義為誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，具有胚胎干細(xì)胞的特征，包括形態(tài)學(xué)、關(guān)鍵多能基因的表達(dá)、以及無限的自我更新能力。人類iPSCs通過四種轉(zhuǎn)錄因子的逆轉(zhuǎn)錄病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生體細(xì)胞，有效誘導(dǎo)成功能性肝細(xì)胞樣細(xì)胞?；堇〉葘⒊衫w維細(xì)胞誘導(dǎo)成具有肝功能的細(xì)胞，并應(yīng)用到生物人工肝中，延長了急性肝衰竭豬的生存時(shí)間。

 

人類間充質(zhì)干細(xì)胞包括骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）、人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）等。骨髓是造血干細(xì)胞和間充質(zhì)肝細(xì)胞的儲(chǔ)存庫，hBMSCs因其在體外相對(duì)容易獲得和擴(kuò)增，可以作為合適的治療細(xì)胞。來自hBMSCs的肝細(xì)胞樣細(xì)胞已經(jīng)成為原代細(xì)胞的替物，可以有效地誘導(dǎo)成功能性肝細(xì)胞。hADSCs與BMSCs不僅具有相似的分化為肝細(xì)胞的潛能的特征，而且獲得也比較容易。人脂肪組織來源的MSC在體外合適的條件下可以分化成為功能性肝細(xì)胞，這可以促進(jìn)體內(nèi)肝臟整合。干細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來的功能性肝細(xì)胞可以大量生產(chǎn)用于肝衰竭的臨床治療。

 

 

（二）生物人工肝裝置

在各類人工肝裝置中，以體外培養(yǎng)肝細(xì)胞作為生物成分的新型生物人工肝被認(rèn)為是最有前途的，己在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床應(yīng)用中取得了較好的療效8。生物反應(yīng)器生物人工肝的核心部分，其性能直接關(guān)系到人工肝支持的效率與效果。它的主要功能是：①為肝細(xì)胞提供良好的生長代謝環(huán)境。②作為患者血液(血漿)與肝細(xì)胞相互作用、進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所。國外學(xué)者一直非常重視生物反應(yīng)器的研究，相繼提出多種設(shè)計(jì)思想與方案，使其性能不斷改進(jìn)。目前生物反應(yīng)器主要有4種：中空纖維反應(yīng)器、灌注床/支架反應(yīng)器、片層平板系統(tǒng)、微囊懸液式，下面就這幾種進(jìn)行詳細(xì)介紹。

 

1、中空纖維反應(yīng)器

中空纖維型生物反應(yīng)器在物質(zhì)傳輸和免疫阻隔方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)，使其成為體外生物人工肝支持系統(tǒng)中使用最多的生物反應(yīng)器9（如圖所示）。其類型包括普通型中空纖維管生物反應(yīng)器、復(fù)合型中空纖維管生物反應(yīng)器和編織型中空纖維管生物反應(yīng)器集中類型，下面就普通型中空纖維管生物反應(yīng)器進(jìn)行詳細(xì)說明。

 

 

圖 中空纖維反應(yīng)器

 

普通型中空纖維管生物反應(yīng)器：該反應(yīng)器由成百上千根多孔空心毛細(xì)纖維管組成，纖維呈平行排列，置于一圓柱形密閉倉內(nèi)，在纖維管半透膜內(nèi)外形成兩個(gè)獨(dú)立的腔隙，即管內(nèi)腔和管外腔，分別用于培養(yǎng)肝細(xì)胞或血液循環(huán)灌注。培養(yǎng)肝細(xì)胞與ALF患者血液處于隔離狀態(tài)，患者血液/血漿由管內(nèi)通過時(shí)，肝細(xì)胞與患者血液之間進(jìn)行物質(zhì)傳輸與交換。但普通中空纖維型反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)決定了反應(yīng)器內(nèi)的肝細(xì)胞分布難以均勻，細(xì)胞黏附性能較差，液體彌散受到一定程度的限制。

 

2、灌注床/支架反應(yīng)器

灌注床/支架生物反應(yīng)器是一類將肝細(xì)胞培養(yǎng)于固定化三維支架的反應(yīng)器 （如圖所示）。在灌注培養(yǎng)條件下，患者血漿能與肝細(xì)胞直接接觸，從而達(dá)到治療的目的。有人采用網(wǎng)狀聚乙烯醇縮甲醛樹脂探究了一種BAL反應(yīng)器用于鼠肝細(xì)胞高密度培養(yǎng)和代謝功能的維持。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過7d培養(yǎng)，灌注培養(yǎng)條件下肝細(xì)胞的氨代謝速率、尿素合成速率和白蛋白分泌速率分別達(dá)到0.0948mM/h、0.165mM/h和1.15µg/h/mL，明顯優(yōu)于靜態(tài)單層培養(yǎng) 。

 

 

圖 灌注床/支架生物反應(yīng)器

 

3、片層平板系統(tǒng)

De-Bartolo等10設(shè)計(jì)出一種平板膜式生物反應(yīng)器（如圖所示），共計(jì)20層氧通透性平板網(wǎng)格式薄膜被平行排列于反應(yīng)器內(nèi)，每層膜的氧通透面積為115 cm2，可種植2×108個(gè)豬肝細(xì)胞，反應(yīng)器內(nèi)最多可放置50層網(wǎng)格式膜，細(xì)胞總數(shù)可達(dá)1×1010

 

以上，各層膜之間平行排列、相對(duì)獨(dú)立，增加膜的數(shù)量不影響反應(yīng)器的結(jié)構(gòu)，可根據(jù)人工肝支持的需要隨時(shí)調(diào)整。通過檢測(cè)DNA含量證實(shí)，在培養(yǎng)的第1天細(xì)胞數(shù)即明顯增加，同時(shí)伴白蛋白、尿素含量的增加。由于該反應(yīng)器不僅充分考慮了重建肝組織結(jié)構(gòu)，達(dá)到高密度培養(yǎng)肝細(xì)胞的目標(biāo)，而且提供了與體內(nèi)相近的微環(huán)境，使肝細(xì)胞保持特殊的肝功能。

 

 

圖 片層平板反應(yīng)器

 

4、微囊懸液式

微囊/流化床生物反應(yīng)器是將肝細(xì)胞用一種半透膜材料包裹而制成的多孔微囊，繼而進(jìn)行懸浮培養(yǎng)的一類反應(yīng)器。近年來，有研究者嘗試構(gòu)建微囊/流化床生物反應(yīng)器（如圖所示）。海藻酸鈉具有良好的生物相容性且易凝膠化，因而被廣泛用作肝細(xì)胞微囊制備的材料11。Lv等采用海藻酸鈉－殼聚糖包埋原代豬肝細(xì)胞，構(gòu)建一種流化床生物反應(yīng)器，并通過肝衰竭豬模型評(píng)價(jià)其解毒能力。經(jīng)過24h后，實(shí)驗(yàn)組豬血漿中的乳酸含量和間接膽紅素含量顯著低于未處理組或假處理組 （未填充肝細(xì)胞的空囊 ）；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的血糖含量和Fisher指數(shù)顯著高于對(duì)照組；并且實(shí)驗(yàn)組豬的存活時(shí)間遠(yuǎn)大于對(duì)照組。因此，基于海藻酸鈉－殼聚糖微囊 的流化床生物反應(yīng)器顯示出緩解豬肝衰竭疾病癥狀且延長存活時(shí)間的作用。

 

圖 流化床生物反應(yīng)器

 

 

小結(jié)：

 

當(dāng)前臨床上主要應(yīng)用的人工肝是非生物型人工肝，其通過濾過、吸附和血漿置換肝衰竭患者血液中的毒素，來改善臨床表現(xiàn)。不過，同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院承辦的《醫(yī)學(xué)參考報(bào)》指出，多項(xiàng)臨床試驗(yàn)表明，非生物人工肝系統(tǒng)不能降低急性肝衰竭死亡率。

 

而生物人工肝則是將患者血漿通過體外循環(huán)與生物反應(yīng)器中的人肝細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)交換，短時(shí)間替代肝臟工作，并促進(jìn)受損肝臟再生修復(fù)，性能上更接近人體肝細(xì)胞?；诖耍渭?xì)胞和反應(yīng)器是生物人工肝的兩大核心要素。相較于動(dòng)物源性肝細(xì)胞、腫瘤源性肝細(xì)胞等種子細(xì)胞，原代肝細(xì)胞理論上最接近人體肝細(xì)胞，是最理想的選擇12，但其存在來源不足，提取困難，難以大批量體外培養(yǎng)的難題。針對(duì)生物人工肝的細(xì)胞來源探索還需要更多的臨床研究。