近期，上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第六人民醫(yī)院范存義、錢(qián)運(yùn)及歐陽(yáng)元明等在科愛(ài)出版創(chuàng)辦的期刊 Bioactive Materials 上聯(lián)合發(fā)表題為：負(fù)載脂肪干細(xì)胞的還原氧化石墨烯（rGO）復(fù)合納米支架介導(dǎo)干細(xì)胞成神經(jīng)分化用于神經(jīng)修復(fù)的研究論文。設(shè)計(jì)了一種將rGO納米顆粒整合到具有各向異性的靜電紡絲纖維束中的智能支架，旨在通過(guò)促進(jìn)所負(fù)載的脂肪干細(xì)胞成神經(jīng)方向分化，來(lái)創(chuàng)新探索神經(jīng)微環(huán)境重建策略。
1、研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介
周?chē)窠?jīng)缺損是臨床常見(jiàn)疾患，每年患病人數(shù)超200萬(wàn)人。其治療難度大，預(yù)后差，致殘率高。自體神經(jīng)移植是目前臨床治療金標(biāo)準(zhǔn)，但來(lái)源有限且存在供區(qū)損傷的缺陷；而異體神經(jīng)移植則存在免疫排斥的問(wèn)題。目前，應(yīng)用神經(jīng)導(dǎo)管產(chǎn)品修復(fù)周?chē)窠?jīng)缺損已成為臨床潛在替代方案和研究熱點(diǎn)。
針對(duì)長(zhǎng)距離周?chē)窠?jīng)缺損再生過(guò)程中神經(jīng)纖維錯(cuò)配、生長(zhǎng)遲緩等難題，該團(tuán)隊(duì)利用靜電紡絲技術(shù)，制備了在納米和微米層面兼具取向性結(jié)構(gòu)的界面支架，其外層由無(wú)規(guī)則排列的微米纖維構(gòu)成，內(nèi)層靜電紡絲纖維取向排列，同時(shí)通過(guò)將纖維內(nèi)的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）化學(xué)試劑洗脫，使導(dǎo)管內(nèi)表面具有軸向排列的納米溝槽和空間分布的功能性還原氧化石墨烯（rGO）納米顆粒，為多種修復(fù)支持細(xì)胞遷移、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成神經(jīng)定向分化提供拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、力學(xué)刺激與趨化信號(hào)。下圖展示了載脂肪干細(xì)胞rGO/PCL神經(jīng)導(dǎo)管的制備流程及內(nèi)外層差異性界面。
圖1：神經(jīng)導(dǎo)管的制備及表征 . (A) 靜電紡絲rGO/PCL的制備過(guò)程及其體內(nèi)外應(yīng)用的示意圖。(B) 神經(jīng)導(dǎo)管實(shí)拍圖和掃描電鏡圖。神經(jīng)導(dǎo)管外層為雜亂無(wú)章的靜電紡絲纖維，內(nèi)層為取向性排列的纖維（綠色）。纖維表面具有縱向排列的納米溝壑和rGO顆粒（紅色）。
體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，取向性微米纖維的表面帶有縱向排列的各向異性的納米溝壑，促進(jìn)脂肪干細(xì)胞沿著神經(jīng)導(dǎo)管軸向排列和延展。對(duì)比聚己內(nèi)酯（PCL）神經(jīng)導(dǎo)管，rGO納米神經(jīng)導(dǎo)管具有促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向施旺細(xì)胞方向和神經(jīng)元方向分化的能力，培養(yǎng)在rGO/PCL支架上的脂肪干細(xì)胞的成神經(jīng)和成膠質(zhì)分化比例分別提高了1.7倍和1.5倍，下圖展示了rGO/PCL神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)脂肪干細(xì)胞增殖、粘附和分化的影響。
圖2: rGO/PCL和PCL神經(jīng)導(dǎo)管對(duì)脂肪干細(xì)胞的增殖、凋亡、粘附、排列、分化及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)表型的影響。
將此帶有物理拓?fù)湟龑?dǎo)結(jié)構(gòu)和rGO納米顆粒的靜電紡絲膜制備成神經(jīng)導(dǎo)管，管腔內(nèi)植入200ul、含脂肪干細(xì)胞密度為107/ml的細(xì)胞-基質(zhì)膠混合物，最終得到負(fù)載脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的表面帶有納米溝槽和導(dǎo)電納米顆粒的神經(jīng)導(dǎo)管，植入大鼠體內(nèi)修復(fù)15 mm坐骨神經(jīng)缺損18周，發(fā)現(xiàn)該神經(jīng)導(dǎo)管可有效促進(jìn)缺損神經(jīng)的再生及功能的恢復(fù)。下圖展示了損傷神經(jīng)在第18周時(shí)髓鞘包裹和軸突再生情況。
圖3: 神經(jīng)導(dǎo)管植入大鼠體內(nèi)18周后神經(jīng)再生情況. MBP（綠）和S100β (綠)反映了再生神經(jīng)髓鞘化水平，TUJ1（紅）和NF200 （紅）反映了再生神經(jīng)中軸突再生水平。統(tǒng)計(jì)圖可見(jiàn)rGO/PCL導(dǎo)管內(nèi)神經(jīng)再生水平與自體神經(jīng)移植效果類(lèi)似，且顯著高于PCL組。
研究人員在神經(jīng)再生第18周時(shí)，對(duì)導(dǎo)管遠(yuǎn)端神經(jīng)內(nèi)注射軸突逆行性示蹤劑，用以評(píng)估軸突完整性及軸突運(yùn)輸功能的重建情況。如下圖可見(jiàn)，與PCL組相比，rGO/PCL組的背根神經(jīng)節(jié)和脊髓內(nèi)有更多神經(jīng)元胞體被標(biāo)記。L3-L5脊髓節(jié)段作為周?chē)窠?jīng)的胞體所在部位，對(duì)周?chē)窠?jīng)損傷和再生具有調(diào)節(jié)作用。下圖展示了L3-L5節(jié)段的脊髓內(nèi)再生信號(hào)的表達(dá)情況，進(jìn)一步證明了載脂肪干細(xì)胞的rGO/PCL神經(jīng)導(dǎo)管具有更高的促軸突再生潛能。
圖4：坐骨神經(jīng)再生水平在上游部位的反饋情況.（A-C）軸突逆行性示蹤劑在脊髓和背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)神經(jīng)元胞體的標(biāo)記情況。（D-E）脊髓中再生信號(hào)nestin(綠色)和GFAP（紅色）表達(dá)情況。
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