流行病等細(xì)菌感染相關(guān)疾病是對公共衛(wèi)生的主要威脅，已成為全球的十大死亡原因之一。因此，迫切需要新的、高效的策略來對抗細(xì)菌感染，并有大量的努力致力于開發(fā)替代抗菌劑?？咕鷦┑臍⒕Ч绾危枰ㄟ^一系列體外抗菌實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證。那么表征抗菌劑抗菌效果的方法有哪些，你知道嗎？
一、平板計(jì)數(shù)法
1.評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
抗菌劑對細(xì)菌進(jìn)行殺菌處理以后，將細(xì)菌稀釋到合適的倍數(shù)進(jìn)行平板涂布并對長出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。通過計(jì)算細(xì)菌存活率或者致死率來表征抗菌劑抗菌效果。
計(jì)算公式如下：
2.應(yīng)用：ZnO/C介導(dǎo)的k-卡拉膠偽巴氏殺菌膜用于金柑保鮮[1]
為了對抗食源性微生物引起的金橘腐病，西北農(nóng)林大學(xué)王建龍教授團(tuán)隊(duì)開創(chuàng)了偽巴氏殺菌的概念，并將其與包裝技術(shù)相結(jié)合開發(fā)了一種用于儲(chǔ)存和保存金橘的新型抗菌包裝膜。首先構(gòu)建了具有優(yōu)異光熱性能的鋅摻雜碳納米顆粒（ZnO/C），然后將其加入k-卡拉膠（KC）基質(zhì)作為填充物中，得到一系列ZnO/C-KC納米復(fù)合薄膜。ZnO/ C-KC薄膜由于近紅外誘導(dǎo)的光熱效果與ZnO組分之間的協(xié)同殺菌作用而表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌性能（抗菌率≥99.8%），其中薄膜殺菌的平衡溫度（60–62 ℃）和保溫時(shí)間（5 min）顯著低于傳統(tǒng)巴氏殺菌。
通過平板涂布實(shí)驗(yàn)，以大腸桿菌（E. coli）和單核增生李斯特菌（L. monocytogenes）分別作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的典型模型，評價(jià)了ZnO/C-KC膜的偽巴氏殺菌活性。與對照組相比，單獨(dú)的KC膜處理使E. coli和L. monocytogenes的存活率略有下降（下降約7%），而NIR輻射對KC膜的抗菌活性沒有顯著影響。對于ZnO/C-KC納米復(fù)合薄膜，在沒有NIR輻射的情況下，觀察到劑量依賴的殺菌效果。由于ZnO的存在，E. coli的存活率從94.0%下降到21.7%，L. monocytogenes的存活率從93.1%下降到36.8%。當(dāng)ZnO/C-KC薄膜暴露于NIR輻射后，由于觸發(fā)的光熱治療（PTT）與ZnO固有的抗菌特性之間的協(xié)同作用，它們對兩種菌株均表現(xiàn)出顯著增強(qiáng)的抗菌活性。
二、活死染色法
1.評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
對細(xì)菌進(jìn)行活死染色也是一種常用的表征抗菌效果的方法。抗菌劑對細(xì)菌進(jìn)行處理后，再對細(xì)菌進(jìn)行活死染色。目前有許多品牌的細(xì)菌活死染色試劑盒，以SYTO-9和PI為例，SYTO-9是一種能夠透過細(xì)胞膜的綠色熒光核酸染料，可用于活的和死的真核細(xì)胞的RNA和DNA染色，以及革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌。PI是一種可對DNA染色的細(xì)胞核染色劑，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。PI不能穿透完整細(xì)胞膜，但對凋亡晚期細(xì)胞和死細(xì)胞的破損細(xì)胞膜能夠穿透，并使細(xì)胞核紅染。
染色結(jié)果如下：
|
細(xì)菌狀態(tài) |
SYTO-9（綠） |
PI（紅） |
染色效果 |
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活且無凋亡和細(xì)胞膜損傷 |
+ |
- |
綠色 |
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活但出現(xiàn)凋亡和細(xì)胞膜損傷 |
+ |
+ |
黃綠色（紅綠重疊） |
|
死（凋亡和細(xì)胞膜損傷） |
- |
+ |
紅色 |
+：陽性結(jié)果；-：陰性結(jié)果
2.應(yīng)用：氧空位介導(dǎo)的α-MoO3殺菌納米催化劑[2]
在表面分子水平上了解納米材料的細(xì)菌失活機(jī)制，對于開發(fā)抗菌材料及其在抑制病原微生物傳播中的應(yīng)用具有重要意義。中國科學(xué)院氣溶膠化學(xué)與物理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃宇研究員團(tuán)隊(duì)制備了一種氧空位介導(dǎo)的殺菌納米催化劑α-MoO3，該催化劑在黑暗中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌活性。通過操縱α-MoO3的表面結(jié)構(gòu)，可以輕松地實(shí)現(xiàn)超氧自由基（?O2-）的生成。?O2-通過攻擊脂多糖（LPS）和磷脂酰乙醇胺（PE）來破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜。
采用紅色熒光碘化丙啶（PI）核酸染色和綠色熒光核酸染料（SYTO-9）進(jìn)行熒光細(xì)胞活/死試驗(yàn)，驗(yàn)證所制備的抗菌劑的抗菌性能。未處理的細(xì)菌顯示出密集的綠色熒光。經(jīng)α-MoO3-0處理后，只能觀察到少量的紅色熒光菌。經(jīng)α-MoO3-120處理后，幾乎所有細(xì)胞均染成紅色，提示細(xì)菌細(xì)胞膜受損，細(xì)菌死亡。
三、掃描電鏡表征法
1.評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
抗菌劑對細(xì)菌進(jìn)行處理后，可能會(huì)引起細(xì)菌形態(tài)的變化，如褶皺凹陷或者破損。因此通過拍攝掃描電鏡觀察細(xì)菌形態(tài)也是表征抗菌劑抗菌效果的手段之一。
2.應(yīng)用：具有高度生物相容性的銀納米團(tuán)簇增強(qiáng)傷口敷料[3]
西北工業(yè)大學(xué)尚利教授團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種具有增強(qiáng)協(xié)同抗菌能力的高生物相容性銀納米團(tuán)簇增強(qiáng)水凝膠。將具有生物活性的姜黃素引入到溶菌酶保護(hù)的超小銀納米簇中，并通過多重相互作用力進(jìn)一步與海藻酸鈉（Sa）水凝膠整合。LC-AgNCs的殺菌作用在于其破壞細(xì)菌膜、產(chǎn)生活性氧(ROS)、耗盡谷胱甘肽和破壞促氧化-抗氧化系統(tǒng)的能力。姜黃素可以調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)ROS平衡，保護(hù)NIH 3T3細(xì)胞免受氧化應(yīng)激，改善LC-AgNCs@Sa的生物相容性。具有長期抗菌能力的LC-AgNCs@Sa由于其抑制炎癥因子（TNF-a）產(chǎn)生、促進(jìn)膠原沉積和促進(jìn)再上皮化的獨(dú)特功能，可有效保護(hù)傷口免受體內(nèi)細(xì)菌入侵，并顯著加速傷口愈合過程。這項(xiàng)研究為設(shè)計(jì)用于廣泛感染性疾病治療的高性能抗菌敷料提供了一種新的通用的策略。
如圖所示，LC-AgNCs處理前的E. coli呈清晰的桿狀，表面光滑，結(jié)構(gòu)完整。經(jīng)LC-AgNCs處理后，細(xì)菌表面起皺，附近許多細(xì)菌的膜融合，表明細(xì)菌嚴(yán)重塌陷。對S. aureus也觀察到類似的結(jié)果，這意味著LC-AgNCs的處理可以顯著破壞細(xì)菌膜的完整性。
四、清除生物膜
1.評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)
近年來，隨著醫(yī)學(xué)界對某些環(huán)境中常見細(xì)菌所致的一些慢性和頑固性疾病的深入了解，發(fā)現(xiàn)生物膜（生物被膜）是導(dǎo)致這些細(xì)菌性疾病難以根治的主要原因。以生物膜形式存在的細(xì)菌對抗生素等殺菌劑、惡劣環(huán)境及宿主免疫防御機(jī)制有很強(qiáng)的抗性，因此評價(jià)抗菌劑對生物膜的抑制效果也是評價(jià)抗菌劑殺菌效果的標(biāo)準(zhǔn)之一。通過結(jié)晶紫染色觀察生物膜剩余面積或者測其OD值可以表征抗菌劑對生物膜的抑制效果。另外也可以用過熒光共聚焦成像來表征對生物膜的抑制效果。
2.應(yīng)用：介孔二氧化硅納米復(fù)合材料具有尖峰納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)和增強(qiáng)的生物膜抑制性能[4]
澳大利亞昆士蘭大學(xué)余承忠教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種“雙活性模板”策略用于二氧化硅復(fù)合材料的設(shè)計(jì)。該策略使用陽離子和陰離子結(jié)構(gòu)導(dǎo)向劑作為雙模板，兩者都具有活性抗菌性能。陽離子-陰離子雙活性模板策略有助于開發(fā)具有尖刺表面的抗菌納米復(fù)合材料。通過雙活性抗菌劑的可控釋放，該納米復(fù)合材料對表皮葡萄球菌顯示出增強(qiáng)的抗菌和抗生物膜特性。
通過檢查納米復(fù)合材料抑制細(xì)菌表面粘附和生物膜形成的效率，進(jìn)一步評估了納米復(fù)合材料的生物膜抑制性能。將納米復(fù)合物或BAC/NaSal添加到浮游細(xì)菌中，用結(jié)晶紫染色來觀察不同處理組的剩余生物膜，如圖所示，對照組和納米復(fù)合材料II組顯示深紫色，表明更多的生物膜形成，BAC/NaSal或納米復(fù)合材料I處理組表現(xiàn)出明顯較淺的顏色，表明其具有抑制生物膜形成的能力。歸一化結(jié)果顯示，納米復(fù)合材料I的抑制效果顯著（33%）優(yōu)于納米復(fù)合材料II（85%）和BAC/NaSal（63%）。為了更好地分析生物膜的厚度，采用三維共聚焦顯微鏡對LIVE/DEAD細(xì)菌進(jìn)行染色和分析。未經(jīng)處理的生物膜的厚度估計(jì)為25 μm。在納米復(fù)合材料I孵育24小時(shí)后，觀察到更薄的生物膜（<10 μm），死亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加（>90%）。而在BAC/NaSal（約15 μm）或納米復(fù)合II（22 μm）處理組上形成較厚的生物膜。以上結(jié)果表明，“雙活性模板”納米復(fù)合材料I在抑制生物膜形成方面表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。
參考文獻(xiàn)
1.Zhang L, Wang W, Ni Y, et al. ZnO/C-mediated k-carrageenan based pseudo-pasteurization films for kumquat preservation[J]. Food Hydrocolloids, 2022, 128: 107582.
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4.Song Y, Sun Q, Luo J, et al. Cationic and Anionic Antimicrobial Agents Co-Templated Mesostructured Silica Nanocomposites with a Spiky Nanotopology and Enhanced Biofilm Inhibition Performance[J]. Nano-micro letters, 2022, 14(1): 1-11.
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