近期發(fā)布的《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見稿）》中提到：固相合成中，樹脂作為必需物料，其質(zhì)量可直接影響多肽藥物質(zhì)量，應(yīng)提供樹脂的來源、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和檢驗(yàn)報(bào)告，并對樹脂的摩爾取代系數(shù)、在不同溶劑中的膨脹系數(shù)、所用合成條件下的穩(wěn)定性情況等予以說明。由于缺乏有效的表征手段和和針對性的質(zhì)控方法，不推薦與肽鏈C端氨基酸相連的樹脂作為起始物料。由此可見，雖然樹脂在有些情況下不參與構(gòu)成最終API的結(jié)構(gòu)，但也應(yīng)對其進(jìn)行充分地研究。今天我就和大家簡單介紹一下多肽固相合成中常用的樹脂。
一、首先我們先要了解幾個(gè)關(guān)于樹脂的重要參數(shù)：交聯(lián)度、目數(shù)、取代度、在不同溶劑中的溶脹度。
交聯(lián)度：以PS樹脂為例，它的樹脂球是在聚苯乙烯中添加一定量的交聯(lián)劑二乙烯基苯，經(jīng)過聚合反應(yīng)而成。交聯(lián)劑二乙烯基苯的加入量就是交聯(lián)度（DVB），樹脂最佳交聯(lián)度為1%，更高的交聯(lián)度導(dǎo)致樹脂溶脹度下降，然而較低的交聯(lián)度會減小樹脂在溶脹狀態(tài)下的機(jī)械穩(wěn)定性。一般來講市售的樹脂大部分都是交聯(lián)度為1%的。
目數(shù)：樹脂球的大小，一般市售樹脂為100-200目(平均直徑為75-150μm)，聚合反應(yīng)的條件可以影響樹脂球的大小。
取代度：每克樹脂裝載了多少毫摩爾的活性反應(yīng)位點(diǎn)，單位是mmol/g。值得注意的是一般市售的Wang-resin，CTC-resin到手后，我們會在實(shí)驗(yàn)室裝載第一個(gè)氨基酸，但這兩種樹脂的氨基酸裝載率并不能達(dá)到100%，所以在此之后應(yīng)該重新測定取代度。
溶脹度：樹脂在不同溶劑中的溶脹能力，單位是ml/g。一般市售的樹脂到手后，我們使用之前都需要用溶劑進(jìn)行溶脹，良好的溶脹能夠增加反應(yīng)物進(jìn)入位點(diǎn)的機(jī)會。DCM、DMF、N-甲基吡咯烷酮都是常用的良性樹脂溶脹溶劑。
二、幾種常用的樹脂介紹
1、Wang-resin
多肽固相合成中常用的樹脂，功能基團(tuán)為羥基，第一個(gè)氨基酸通過酯鍵和樹脂的Linker相連。因此偶聯(lián)條件要比酰胺鍵劇烈，需要DMAP催化。由于DMAP堿性較強(qiáng)，特別容易消旋的氨基酸(Cys,His)不適合裝載于Wang-resin，此時(shí)推薦使用CTC-resin。
此外，當(dāng)Wang-resin碳端二肽中含有Gly、Pro時(shí)，還應(yīng)注意DKP副反應(yīng)，機(jī)理見圖2。N-端氨基酸脫Fmoc后裸露出氨基，對前面的酰胺鍵或酯鍵親核進(jìn)攻，受影響的片段以二酮哌嗪的形式從樹脂脫落，最終導(dǎo)致收率下降。當(dāng)C-端前兩個(gè)氨基酸中有Gly，Pro，N-烷基氨基酸，交替的D/L型氨基酸時(shí)會加速這一副反應(yīng)。當(dāng)使用的固定相的Linker類型為酯鍵時(shí)，這種副反應(yīng)最為嚴(yán)重，因?yàn)楸绕鸢被?，羥基是一個(gè)更強(qiáng)的離去基團(tuán)。使用CTC-resin可以抑制此副反應(yīng)。
Wang-resin的linker比較穩(wěn)定，需要高濃度TFA裂解。在高濃度TFA條件下裂解，Wang-resin的linker可能會發(fā)生不規(guī)則裂解產(chǎn)生正離子1，如果肽鏈中存在Trp殘基，正離子可能會進(jìn)攻Trp殘基側(cè)鏈的吲哚環(huán)引產(chǎn)生M+106的雜質(zhì)，機(jī)理見圖3。正常情況下，Wang-resin的linker在A處斷裂，但是當(dāng)肽鏈中含有一些難以脫除的側(cè)鏈保護(hù)基時(shí)(如Arg的側(cè)鏈Pbf,DOTA環(huán)的羧基保護(hù)基tBu等)，就不得不使用更強(qiáng)的切割條件，這時(shí)Wang-resin的linker就有可能發(fā)生不規(guī)則的裂解，在A和B處同時(shí)斷裂，產(chǎn)生正離子1，這種離子特別容容易進(jìn)攻Trp側(cè)鏈。使用CTC-resin可以完全規(guī)避此副反應(yīng)，如果一定要使用Wang-resin，可以降低切割溫度，縮短切割時(shí)間來控制此副反應(yīng)。
圖1
圖2
圖3
2、CTC-resin
多肽固相合成中常用的樹脂，對水極為敏感。裝載第一個(gè)氨基酸時(shí)不需要預(yù)活化，直接把氨基酸和DIPEA的溶液加入樹脂就可以反應(yīng)，因此可以完全規(guī)避Wang-resin裝載第一個(gè)氨基酸時(shí)產(chǎn)生的消旋副反應(yīng)。同時(shí)，由于CTC-resin的linker上的氯原子的臨位效應(yīng)，也能夠有效抑制DKP副反應(yīng)。
CTC-resin的linker不穩(wěn)定，低濃度TFA就可以使其裂解，因此在合成過程中可能會有部分肽鏈從樹脂脫落導(dǎo)致收率降低，但也正因?yàn)檫@個(gè)特性，我們可以用低濃度TFA裂解肽樹脂從而得到側(cè)鏈全保護(hù)的多肽片段，用于多肽片段合成法。
CTC-resin
3、Rink amide-resin
最常用的用于制備肽酰胺的樹脂，功能基團(tuán)為氨基。通常我們使用的是氨基被Fmoc保護(hù)的Rink amide-resin，裝載第一個(gè)氨基酸時(shí)應(yīng)先脫除Fmoc,然后進(jìn)入正常偶聯(lián)洗滌脫保護(hù)的循環(huán)。Rink amide-resin的linker比較穩(wěn)定，需要高濃度TFA裂解,因此也會產(chǎn)生和Wang-resin類似的副反應(yīng)(見圖5)。如果肽鏈中含有Trp殘基，也應(yīng)注意類似的副反應(yīng)。
Rink amide-resin
圖5
4、Sieber-resin
制備肽酰胺的樹脂，價(jià)格比較貴。與Rink amide-resin一樣，功能基團(tuán)為氨基。通常我們使用的是氨基被Fmoc保護(hù)的Sieber-resin，裝載第一個(gè)氨基酸時(shí)應(yīng)先脫除Fmoc,然后進(jìn)入正常偶聯(lián)洗滌脫保護(hù)的循環(huán)。不同的是Sieber-resin的linker不如Rink amide-resin的穩(wěn)定，可以用低濃度TFA裂解肽樹脂從而得到側(cè)鏈全保護(hù)的C-端酰胺化的多肽片段。
Sieber-resin
三、我們已經(jīng)對以上幾種樹脂進(jìn)行了概述，下面我把這幾種樹脂的特性做一個(gè)表格供大家參考
參考文獻(xiàn)：
1：《化學(xué)合成多肽藥物藥學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則 （征求意見稿）》
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