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通常樣品基質(zhì)復(fù)雜，檢測(cè)中普遍存在的基質(zhì)效應(yīng)，基質(zhì)效應(yīng)是分析結(jié)果的準(zhǔn)確度與精密度的關(guān)鍵因素，影響LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果靈敏度和準(zhǔn)確度的主要因素也是基質(zhì)效應(yīng)，所以，今天我們就聊一聊如何有效消除LC-MS/MS基質(zhì)效應(yīng)。

 

什么是基質(zhì)效應(yīng)？

 

化學(xué)分析中，基質(zhì)指的是樣品中被分析物以外的組分?；|(zhì)常常對(duì)分析物的分析過(guò)程有顯著的干擾，并影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。例如，溶液的離子強(qiáng)度會(huì)對(duì)分析物活度系數(shù)有影響，這些影響和干擾被稱為基質(zhì)效應(yīng)(matrix effect)。

 

LC-MS/MS分析中非目標(biāo)分析物作為樣品中的共流出物，對(duì)目標(biāo)分析物的離子化會(huì)產(chǎn)生影響和干擾，這些影響和干擾就是基質(zhì)效應(yīng)。

 

基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生機(jī)制

 

在LC-MS/MS中，基質(zhì)效應(yīng)是由于非目標(biāo)分析物與目標(biāo)物共同流出噴霧針，對(duì)電荷產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)，它們將產(chǎn)生的霧滴牢牢吸在一起，阻止其分裂成更小的微滴，改變了帶電霧滴的表面張力，從而導(dǎo)致目標(biāo)物的離子化效率降低或增強(qiáng)，引起響應(yīng)降低或增高，便產(chǎn)生了所謂的基質(zhì)抑制效應(yīng)或基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。

 

 

基質(zhì)效應(yīng)的來(lái)源

 

基質(zhì)效應(yīng)主要來(lái)源于生物樣品的內(nèi)源性組分，經(jīng)前處理后仍存在于提取液中。包括離子顆粒物成分(電解質(zhì)、鹽類)、強(qiáng)極性化合物(酚類、色素)和各種有機(jī)化合物(糖類、胺類、尿素、脂類、肽類及其分析目標(biāo)物的同類物及其代謝物)。

 

其中磷脂是最主要的內(nèi)源性組分, 其對(duì)電噴霧電離(ESI)和大氣壓化學(xué)電離 (APCI)均會(huì)產(chǎn)生離子抑制作用。含有P=O、-O-CO-NH-、OH、R-NH-、-N=、-NH-CO-NH- 等基團(tuán)的農(nóng)藥通常表現(xiàn)出較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)。由樣品處理過(guò)程引入的外源性組分，同樣會(huì)產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)。主要包括無(wú)機(jī)離子、緩沖溶液、有機(jī)酸、離子對(duì)試劑、增塑劑、表面活性劑殘留、固相萃?。⊿PE）小柱材料及色譜柱固定相流失物等。

 

基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

 

LC-MSMS分析方法的基質(zhì)效應(yīng)評(píng)價(jià)方法主要有兩種，分別為柱后注入法（Post-column infusion method）和提取后加入法（ Post-extraction spike method）。

 

方法一：柱后注入法

柱后注入法評(píng)價(jià)LC-MS方法中的基質(zhì)效應(yīng)流程圖

 

柱后注入法的優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：可以實(shí)時(shí)看到各個(gè)分析時(shí)間段的基質(zhì)效應(yīng)情況。

 

缺點(diǎn)：

不能量化基質(zhì)效應(yīng)是其最大弱點(diǎn)。（其實(shí)在實(shí)際分析過(guò)程中，我們更關(guān)注的是基質(zhì)效應(yīng)的量化，尤其是相對(duì)量化基質(zhì)效應(yīng)）

 

柱后注入法不能評(píng)價(jià)低濃度分析物水平的基質(zhì)效應(yīng)，如LLQC濃度水平。因?yàn)槟繕?biāo)分析物是通過(guò)注射泵直接注入質(zhì)譜的，所以低濃度水平信號(hào)很難測(cè)到。

 

方法二：提取后加入法

 

 

提取后加入法評(píng)價(jià)LC-MS方法中的基質(zhì)效應(yīng)流程圖

 

提取后加入法的優(yōu)缺點(diǎn)：

優(yōu)點(diǎn)：可以實(shí)現(xiàn)基質(zhì)效應(yīng)的量化評(píng)價(jià)，目前各法規(guī)文件上采用的評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)的方法。

缺點(diǎn)：暫無(wú)。

 

看到這里，細(xì)心的小伙伴們就會(huì)有這樣一個(gè)疑問(wèn)：在我們?nèi)粘５腖C-MS分析方法中，我們大都是用內(nèi)標(biāo)法去定量的，其實(shí)內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)也會(huì)影響到定量的準(zhǔn)確性，那么這時(shí)候我們?cè)撛趺慈ピu(píng)價(jià)方法的基質(zhì)效應(yīng)呢？

 

在藥典2015版四部通則9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則中就用內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子去評(píng)價(jià)這種情況下的基質(zhì)效應(yīng)。

對(duì)于每批基質(zhì)，應(yīng)該通過(guò)計(jì)算基質(zhì)存在下的峰面積（由空白基質(zhì)提取后加入分析物和內(nèi)標(biāo)測(cè)得），與不含基質(zhì)的相應(yīng)峰面積（分析物和內(nèi)標(biāo)的純?nèi)芤海┍戎担?jì)算每一分析物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子。進(jìn)一步通過(guò)分析物的基質(zhì)因子除以內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)因子，計(jì)算經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子。從 6 批基質(zhì)計(jì)算的內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)因子的變異系數(shù)不得大于 15%。該測(cè)定應(yīng)分別在低濃度和高濃度下進(jìn)行。

 

基質(zhì)效應(yīng)的消除和補(bǔ)償

 

1、樣品前處理

改進(jìn)前處理方法、純化樣品、盡可能地減少終提取液中的基質(zhì)成分是有效、徹底地消除基質(zhì)效應(yīng)的方法。

 

生物樣品的前處理方法很多，研究普遍認(rèn)為利用蛋白質(zhì)沉淀法或稀釋法處理的樣品，其基質(zhì)效應(yīng)明顯高于SPE或LLE方法。

 

盡管樣品前處理過(guò)程繁瑣，但樣品純化仍是最佳的基質(zhì)效應(yīng)消除方法。

 

傳統(tǒng)的消除基質(zhì)效應(yīng)的前處理方法有：蛋白質(zhì)沉淀(PPT)、液液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、樣品稀釋(或減少進(jìn)樣量)等。

 

2、同位素內(nèi)標(biāo)

同位素內(nèi)標(biāo)不但可抵消質(zhì)譜離子化時(shí)的基質(zhì)效應(yīng)，還可消除樣品前處理過(guò)程中的差異。

但同位素內(nèi)標(biāo)購(gòu)置困難，且在多個(gè)分析物同時(shí)檢測(cè)時(shí)，由于存在極性差異，即使是同類物的同位素內(nèi)標(biāo)也很難抵消基質(zhì)效應(yīng)，造成定量結(jié)果偏差。

 

3、色譜分離

合適的色譜分離也可降低基質(zhì)效應(yīng)。

采用柱后法確定基質(zhì)效應(yīng)的出現(xiàn)時(shí)間，即可調(diào)整色譜條件，使分析物避免在此段時(shí)間內(nèi)出峰。

此方法在高通量分析時(shí)無(wú)法使用，但可用快速梯度的方法將分析物與溶劑分離。

 

4、質(zhì)譜分析

基質(zhì)效應(yīng)隨離子源、離子化模式和儀器的不同而不同。

修正質(zhì)譜分析是一種比較易行的方法，無(wú)需改變樣品的前處理和色譜條件。

雖然APCI同樣存在基質(zhì)效應(yīng)，但是對(duì)于特定的化合物，特別是對(duì)于蛋白質(zhì)沉淀法處理的樣品，若采用ESI有明顯的基質(zhì)效應(yīng)，但可能該基質(zhì)并不影響APCI的離子化。

 

另外，APPI因其離子化機(jī)制不同于APCI和ESI，也不會(huì)產(chǎn)生相似的基質(zhì)效應(yīng)。

 

5、采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液, 即將空白樣品經(jīng)前處理后，加入一定量待測(cè)物標(biāo)準(zhǔn)，用以對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行校正。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正，是最常用的補(bǔ)償基質(zhì)效應(yīng)的方法。在國(guó)內(nèi)外液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法研究中應(yīng)用十分廣泛。

 

總結(jié)

 

綜上所述，在具體的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法開發(fā)過(guò)程中，首先要根據(jù)目標(biāo)化合物的性質(zhì)、基質(zhì)類型、檢出限要求等對(duì)前處理方法進(jìn)行優(yōu)化，比較多種前處理方法的凈化效果，兼顧基質(zhì)效應(yīng)和回收率，盡可能多的消除可引起基質(zhì)效應(yīng)的內(nèi)源性物質(zhì)；

 

其次，選擇合適的離子源并對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，以得到最優(yōu)的分離效果，避免共流出物的影響。選擇合適的內(nèi)標(biāo)物、采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液校正是對(duì)產(chǎn)生的基質(zhì)效應(yīng)的補(bǔ)償，以抵消基質(zhì)效應(yīng)的影響，是在前處理以及儀器條件無(wú)法消除基質(zhì)效應(yīng)的情況下的補(bǔ)償措施，以保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。