本篇主要介紹熒光內(nèi)窺鏡的定義，原理及組成，簡要介紹了熒光內(nèi)窺鏡中熒光分子探針的結(jié)構(gòu)與性能，重點(diǎn)介紹了內(nèi)窺鏡光學(xué)系統(tǒng)中攝像系統(tǒng)、冷光源、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)的組成以及參數(shù)要求。
傳統(tǒng)白光成像缺乏疾病特異性的光學(xué)特征，無法定位和可視化癌前病變，另外某些疾病病變的彌漫性和斑片狀，進(jìn)一步阻礙了檢測。隨著技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展，逐漸開始進(jìn)行提高病變組織識別率的技術(shù)探索：窄帶成像方法、激光共聚焦成像方法、自體熒光成像和光學(xué)分子成像1。本文以下內(nèi)容主要介紹光學(xué)分子成像。
光學(xué)分子成像技術(shù)使用熒光標(biāo)記物與生物體內(nèi)的小分子、蛋白質(zhì)或者抗體等結(jié)合，借助這些熒光標(biāo)記物進(jìn)行診斷。在激發(fā)光的激發(fā)下，標(biāo)記的腫瘤細(xì)胞等病變組織與正常組織圖像呈現(xiàn)出高對比，醫(yī)生可以觀察腫瘤大小、輪廓等信息，從而監(jiān)測腫瘤的生長、位置轉(zhuǎn)移等狀態(tài)。在腫瘤切除手術(shù)過程中，通過對腫瘤組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行熒光標(biāo)記，實(shí)時顯示腫瘤區(qū)域熒光圖像，可以幫助外科醫(yī)生對腫瘤形狀等特征進(jìn)行判別，從而實(shí)現(xiàn)與正常健康組織區(qū)分，達(dá)到精準(zhǔn)治療的目的。
一、熒光
1.1 熒光分類以及原理
物質(zhì)產(chǎn)生熒光的原因大概可以分為幾類：
（1）光致熒光：由可見光激發(fā)的熒光；
（2）化學(xué)熒光：由化學(xué)反應(yīng)引起的熒光；
（3）X 射線熒光：由 X 射線引起的熒光；
（4）激光熒光：由激光引起的熒光；
（5）生物發(fā)光：在有生命的生物體中產(chǎn)生的熒光。
熒光內(nèi)窺鏡的熒光產(chǎn)生主要是激光激發(fā)。
可見光的波長范圍為 380-760nm，紅外的波長范圍大約在 0.76-50 μm之間。當(dāng)熒光物質(zhì)被外界特定能量（如激光等）激發(fā)，會引起熒光物質(zhì)的電子由低能級（基態(tài)）躍遷至高能級（激發(fā)態(tài)），然后電子又會由高能級釋放能量回歸低能級。在由高能級向低能級躍遷的過程中，電子會釋放能量，能量以一定頻率光波的形式被釋放，產(chǎn)生的光波為熒光。
圖 熒光產(chǎn)生的原理圖
1.2 熒光探針
熒光探針是熒光成像技術(shù)最重要的載體。熒光探針主要由目標(biāo)底物的識別基團(tuán)和熒光染料兩部分構(gòu)成，在目標(biāo)物的作用下，識別基團(tuán)從探針分子上脫落，從而裸露出熒光團(tuán)進(jìn)而發(fā)揮成像的作用2。目前，可用于探針設(shè)計(jì)的有機(jī)熒光染料主要包括以下幾種：香豆素、氟硼熒、花菁和羅丹明；而無機(jī)熒光材料主要包括量子點(diǎn)和一些納米材料。
近紅外熒光探針因其結(jié)構(gòu)相對簡單、易于合成以及功能較多的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。近10年來，熒光成像技術(shù)主要集中在近紅外窗口，近紅外一區(qū)（NIR-I，700-900nm）熒光成像以其高靈敏度、快速反饋、無危害輻射、低成本等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)研究中受到廣泛關(guān)注3。其常用的熒光母體主要有如下幾類：花菁類、氧雜蒽類、BODIPY 類等。
傳統(tǒng)的花菁類染料具有較大的摩爾消光系數(shù)、較高的吸收截面、可控的吸收和發(fā)射波長以及較低的生物毒性等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于離子檢測及腫瘤定位等研究領(lǐng)域中?；ㄝ既玖系膬?yōu)點(diǎn)使其成為近紅外熒光探針的重點(diǎn)研究方向之一。
花菁類染料通常是兩個含氮芳香雜環(huán)通過奇數(shù)個碳原子的聚乙炔鏈相連接形成的大共軛結(jié)構(gòu)，其發(fā)射波長在 650-900 nm 之間。其分子內(nèi)的 1，2-亞乙烯基（=CH-CH=）單元的增加或減少可實(shí)現(xiàn)對花菁染料吸收和發(fā)射波長的動態(tài)調(diào)整。據(jù)報道，每增加一個 1，2-亞乙烯基單元，就會使得相應(yīng)的花菁染料的吸收波長紅移100 nm4。
圖 花菁染料的結(jié)構(gòu)一般通式
其中最具代表的分子染料是獲得FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用的吲哚菁綠ICG，該分子的熒光發(fā)射峰在800nm左右。
吲哚箐綠（ICG）又稱靛青綠或福氏綠，是一種三碳箐染料，其特點(diǎn)為5：
最大吸收波長805nm，最大熒光波長835nm，均在近紅外光范圍內(nèi)；
與血漿蛋白結(jié)合率高達(dá)98%，主要與血漿中較大分子的高密度和低密度脂蛋白相結(jié)合，形成較大體積的ICG-血漿蛋白復(fù)合體，故極少從脈絡(luò)膜毛細(xì)血管漏出；
ICG 分子為三維立體結(jié)構(gòu)，其兩個多環(huán)結(jié)構(gòu)具有親脂性（如親磷脂成分），而其硫酸鹽基團(tuán)具有親水性，因此 ICG 具有親脂和親水的雙重特性；
ICG 的血漿清除有兩個高峰，第1個高峰在染料注入后的3~4min，第2個高峰在1h 后。
圖 熒光顯影示意圖
圖 ICG吸收以及激發(fā)光譜
二、熒光電子內(nèi)窺鏡結(jié)構(gòu)組成
熒光電子內(nèi)窺鏡主要由攝像系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、光源和顯示器四部分組成。熒光內(nèi)窺鏡在技術(shù)特點(diǎn)上的難度主要體現(xiàn)在以下兩個方面：
1）設(shè)計(jì)和制造。為實(shí)現(xiàn)在寬光譜范圍內(nèi)400-900nm矯正像差（即白光圖像和熒光圖像切換時不需另行調(diào)節(jié)焦距），熒光內(nèi)窺鏡需45-50片光學(xué)透鏡并采用特殊的光學(xué)結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，普通白光內(nèi)窺鏡通常僅需30-35片光學(xué)透鏡；
2）鍍膜技術(shù)。由于熒光內(nèi)窺鏡的鏡片數(shù)量遠(yuǎn)超過普通白光內(nèi)窺鏡，其單面反射率需控制在0.3%以內(nèi)，從而實(shí)現(xiàn)高透過率和高對比度。白光內(nèi)窺鏡的單面反射率控制范圍則為0.5%以內(nèi)6。
圖 海泰新光熒光內(nèi)窺鏡示意圖
圖 熒光內(nèi)窺鏡原理示意圖7
2.1 攝像系統(tǒng)
攝像系統(tǒng)主要由機(jī)械結(jié)構(gòu)、圖像傳感器、光學(xué)成像系統(tǒng)、內(nèi)部導(dǎo)線、導(dǎo)光光纖等組成，功能為將待觀察的表面信息，由光信號轉(zhuǎn)換成電信號。
2.2 圖像傳感器
圖像傳感器是一種將光學(xué)圖像信號轉(zhuǎn)換為電子信號的器件，分為光導(dǎo)攝像管和固態(tài)圖像傳感器兩種。圖像傳感器并不是電子內(nèi)窺鏡的獨(dú)有器件，硬管式內(nèi)窺鏡和光學(xué)纖維內(nèi)窺鏡也可連接圖像傳感器，電子內(nèi)窺鏡中的圖像傳感器位置在攝像系統(tǒng)的前端，另外兩種內(nèi)窺鏡在位于后端手柄處。
固態(tài)圖像傳感器分為電荷耦合器件圖像傳感器（CCD）和互補(bǔ)金屬氧化物半導(dǎo)體圖像傳感器（CMOS）。這兩種圖像傳感器的均是將光信號轉(zhuǎn)換電信號的工作原理。二者主要對比如下圖所示8：
CMOS 圖像傳感器近年來增長迅速，已接近全面替代CCD傳感器。在這樣的背景下，行業(yè)主要參與者都在加大CMOS 圖像傳感器的研發(fā)投入力度。
在各應(yīng)用領(lǐng)域的主流產(chǎn)品中，絕大部分采用了三巨頭的CMOS傳感器。市場熱門的手機(jī)都是采用索尼、三星與豪威科技(Omnivision，簡稱OV，韋爾股份收購)的產(chǎn)品，這三家把持著大部分消費(fèi)類電子領(lǐng)域CMOS傳感器的市場份額。而在汽車和安防等行業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域，一般都是選用安森美，OV與索尼三家的產(chǎn)品。
行業(yè)龍頭索尼在2016年占據(jù)了42%的市場份額，產(chǎn)品涵蓋各個消費(fèi)類電子到各類行業(yè)應(yīng)用(如汽車、安防、工業(yè)等)，且主攻高端市場，技術(shù)實(shí)力最強(qiáng);其次是三星，主攻消費(fèi)類電子市場，多是自產(chǎn)自銷，在技術(shù)上緊追索尼，已經(jīng)可以提供與索尼同級別的CMOS傳感器，但三星的產(chǎn)品在行業(yè)應(yīng)用較少;第三位豪威科技，在行業(yè)應(yīng)用上有多年積累，尤其是在車載 CMOS傳感器應(yīng)用領(lǐng)域，市占率高于索尼9。
2.3 光學(xué)成像系統(tǒng)10
光學(xué)成像系統(tǒng)承擔(dān)的則是將待拍攝的畫面呈現(xiàn)在 CMOS or CCD上，光學(xué)成像系統(tǒng)是三大種類內(nèi)窺鏡共有部分，也是熒光電子內(nèi)窺鏡必不可少的部分。光學(xué)成像系統(tǒng)由一組鏡片組成，其鏡片材料通常為玻璃或者人工樹脂，手機(jī)相機(jī)的鏡組材料通常是后者，而單反相機(jī)的鏡組材料通常為前者。
圖 前端物鏡鏡片組合
2.4 光學(xué)系統(tǒng)主要參數(shù)11：
視場角，物體圖像的入射光線，最先通過物鏡玻璃，進(jìn)入物鏡后平行傳導(dǎo)。進(jìn)入物鏡的入射光線和水平線的夾角，即視角（DOV），Direction Of View. 內(nèi)窺鏡視角一般有0°，12°，30°，70°，90°。
醫(yī)用的電子內(nèi)窺鏡和光學(xué)纖維內(nèi)窺鏡的前端均可彎曲，但光學(xué)纖維內(nèi)窺鏡因?yàn)楣饫w易斷裂，和金屬做成的電纜相比，韌性遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足，醫(yī)用電子內(nèi)窺鏡的最大彎曲角度為 270°，光學(xué)系統(tǒng)的視場角為 90°時，即可保證觀察無盲區(qū)。
視野，物鏡可以觀察到的范圍，稱為視野（FOV）, Field Of View. 內(nèi)窺鏡視野范圍一般分為廣角，標(biāo)準(zhǔn)角。
通光孔徑，光學(xué)成像系統(tǒng)的通光孔徑的大小，影響光學(xué)成像系統(tǒng)的景深和采光能力，通光孔徑越大，光學(xué)成像系統(tǒng)的采光能力則越強(qiáng)，圖像越明亮清晰，所需要的光源照明亮度則越低，但是系統(tǒng)的景深則越小。
光學(xué)成像系統(tǒng)分辨率，是指"物"在經(jīng)過光學(xué)系統(tǒng)后的"像"在細(xì)節(jié)上能被分辨的最小距離。大于這個距離的兩個像點(diǎn)就能被識別為兩個點(diǎn)，而小于這個距離的兩個點(diǎn)經(jīng)過光系統(tǒng)后就會被識別為一個點(diǎn)。圖像傳感器的光學(xué)分辨率是用每毫米上可以分辨的黑白線對數(shù)來表示，即每毫米的寬度上，有多對像元。
圖 從"物"到"像"的失真12
這里需要區(qū)別的是我們常規(guī)了解的圖像分辨率，圖像分辨率的定義是單位距離內(nèi)的像用多少個像素來顯示。例如：智能手機(jī)相機(jī)，使用的微型圖像傳感器的像素高達(dá) 2000 萬甚至 4000 萬。從像素值而言，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于現(xiàn)在的單反相機(jī)，可是，攝影愛好者依然是經(jīng)常手持單反拍攝而不是手持手機(jī)拍攝，其主要原因就在于，手機(jī)相機(jī)所匹配的光學(xué)成像系統(tǒng)的鏡頭模組，分辨率是達(dá)不到對應(yīng)圖像傳感器的光學(xué)分辨率的。所以，決定整個相機(jī)拍攝的分辨率的是光學(xué)成像系統(tǒng)。
景深，即景物的影像的清晰深度，它是光學(xué)系統(tǒng)可以清楚觀察到的從近到遠(yuǎn)的一段距離。在這段距離內(nèi)，場景中的物體不論是移近鏡頭，還是移向遠(yuǎn)處，都能夠形成清晰的圖像。
三、光源13
3.1 光源分類及對比
照明光源是電子內(nèi)窺鏡的核心之一，主要由光源系統(tǒng)和導(dǎo)光光纖組成，主要功能是為腔體照明。照明光源有LED光源、氙氣燈、鹵素?zé)?、白熾燈、汞燈、金鹵燈。但都還不是絕對的冷光，在很多條件下并不能直接用于患者，需要通過一定的方式將這些光源轉(zhuǎn)化為冷光(降級色溫)。首先，要采用真空鍍膜的非球形反射鏡面，該鏡面通過鍍膜能夠吸收大量的紅外線，使得發(fā)光溫度得到有效的降低，為了保證鍍膜的正常工作，還要在光源旁邊加上冷卻風(fēng)扇。確保其散熱性能。
圖片表 白熾燈、熒光燈、金鹵燈、氙氣燈和 LED 燈的數(shù)據(jù)
近年來，LED技術(shù)正在成為內(nèi)窺鏡的首選光源，特點(diǎn)壽命長、穩(wěn)定性高、而且更容易集成在內(nèi)窺系統(tǒng)中。結(jié)合高速發(fā)展的微電子學(xué)和光學(xué)，LED照明為該領(lǐng)域帶來了各種新的發(fā)展和應(yīng)用。
氙氣燈具有寬光譜范圍，提供高亮、穩(wěn)定的寬帶輸出和均勻照明，不僅是很多生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的理想選擇，更是極大地改進(jìn)了內(nèi)窺鏡技術(shù)和深度腔內(nèi)手術(shù)照明。氙燈比傳統(tǒng)白熾燈的壽命更長，性能比鹵素?zé)舾鼉?yōu)越。氙燈也具有更理想的相關(guān)色溫（CCT，如下圖所示）和顯色指數(shù)（CRI）。
暖色紅-橙光相比冷色藍(lán)-白光具有更低的色溫。用于內(nèi)窺鏡的先進(jìn)LED系統(tǒng)允許用戶調(diào)節(jié)每種可見光顏色，得到使人舒適的CCT水平，從而降低眼睛疲勞。
圖 CCT（相關(guān)色溫）展示
CRI用于表征光源還原被觀察物體顏色的好壞。CRI越高，越能準(zhǔn)確地還原物體顏色（如圖所示）。這一點(diǎn)對于醫(yī)學(xué)專家很重要，因?yàn)樗麄兡軌蚋鶕?jù)色差識別解剖情況。氙燈是觀察組織真實(shí)顏色的理想照明光源，幫助提高診斷和治療的準(zhǔn)確度。
圖 顯色指數(shù)（CRI）
3.2 照明光源安裝方式
照明光源安裝方式，有前置安裝和后置安裝兩種，前置安裝是采用微型LED燈珠，將燈珠與鏡頭并排安裝，內(nèi)窺鏡的前端為細(xì)孔徑，空間位置很小，照明光源僅能采用微型 LED，沒有額外的空間為光源進(jìn)行散熱系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，使得其散熱問題難以解決，以致光源的功率較低，使得整體照明亮度有限。
后置照明光源安裝，需借助導(dǎo)光光纖將照明光導(dǎo)入腹腔，光纖導(dǎo)光的效果如下圖所示。后置照明光源安裝，照明光源的空間體積不受限制，有足夠的空間對光源進(jìn)行散熱系統(tǒng)的設(shè)計(jì)，光源的功率不因散熱問題受到限制，可以提高 LED 燈光源的功率來增加照明亮度。在維護(hù)與更換上難度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于前置照明安裝，油水環(huán)境下，光源電路不受影響，僅有普通的使用損耗。
圖 導(dǎo)光光纖
LED最大的優(yōu)勢就是裝配簡單，功耗較低，而光纖最大的優(yōu)勢就是在頭端部不會產(chǎn)生熱量，且占用頭端部的空間較小。因?yàn)楣饫w束只傳導(dǎo)光，本身不會發(fā)熱，且光纖束由若干根 直徑25-50μｍ的光纖絲組成，可以根據(jù)不同的頭端部設(shè)計(jì)成各種形狀，以適應(yīng)各種各樣的成像器件及尺寸要求14。
圖 光纖導(dǎo)光形狀
3.3 熒光光源結(jié)合方式
當(dāng)前腹腔鏡與光學(xué)分子成像技術(shù)相結(jié)合的方式主要分為雙光源雙光路成像和雙光源單光路成像兩種機(jī)制。
雙光源雙光路成像系統(tǒng)含有兩個光源：激發(fā)光光源和白光光源；兩個相機(jī)：熒光相機(jī)采集成像部位的熒光信息，彩色相機(jī)采集與普通內(nèi)窺鏡成像效果相同的白光圖像。兩種光源通過光纖或者分光棱鏡耦合后送入內(nèi)窺鏡中照射成像區(qū)域，激發(fā)成像區(qū)所吸收的熒光試劑使其發(fā)射出另一譜段的發(fā)射光。內(nèi)窺鏡采集發(fā)射光同時將采集到的分成兩部分，一部分經(jīng)過可見光濾光片（400-650 nm）送入彩色相機(jī)中，另外一部分經(jīng)過發(fā)射光濾光片（根據(jù)熒光試劑的發(fā)射譜段來定）送入熒光相機(jī)中成像15。
圖 內(nèi)窺式雙光源雙光路熒光分子成像系統(tǒng)原理示意圖
雙光源單光路成像系統(tǒng)，為了減小成像系統(tǒng)的體積，一些系統(tǒng)采用單光路成像。通過一組濾光輪交替進(jìn)行白光和熒光成像，或者通過在一定時間間隔內(nèi)同步觸發(fā)激發(fā)光源和相機(jī)、白光光源和相機(jī)，用一臺相機(jī)來獲取熒光圖像和白光圖像。這種方法系統(tǒng)體積小，操作靈活方便，但是不能同時獲取白光圖像和熒光圖像。
圖 內(nèi)窺式雙光源單光路熒光分子成像系統(tǒng)原理示意圖
3.4 圖像采集方案16
在正常白色照明光源下肉眼和攝像頭均無法識別熒光波長，若要清晰識別熒光圖像，只有將照明光源關(guān)閉。因此，正常照明的明場圖像與無光源照明的熒光圖像無法在同一時間內(nèi)采集。
為了實(shí)現(xiàn)在正常照明模式下將熒光標(biāo)記腫瘤部位顯示出來，采用分時段采集白光圖像和熒光圖像后再進(jìn)行處理融合標(biāo)記。而為了保證最終處理融合標(biāo)記的圖像的準(zhǔn)確性，處理融合標(biāo)記時使用的兩種圖像的采集時間差應(yīng)降到最低，可最大限度的讓兩種圖像的實(shí)際誤差降到最低，而最低時間差為攝像頭的單幀拍攝時間。
圖 照明光源與激發(fā)光源時序生成示意圖
熒光圖像和光、明場圖像間隔拍攝，每次融合時使用最新采集得到的圖像，可保證融合的結(jié)果圖像的準(zhǔn)確性。
圖 圖像采集方法示意圖
四、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)
內(nèi)窺鏡的圖像處理中心，核心功能是將拍攝采集到的圖像進(jìn)行處理加工然后顯示出來，也可在此進(jìn)行錄像、數(shù)據(jù)保存、歸檔、分析等。顯示器則是處理的圖像顯示出來。
通過前面章節(jié)敘述，攝像系統(tǒng)采集到的數(shù)據(jù)圖像為兩種類型不同的圖片，其一為正常白色光源照明下拍攝所得的明場圖像，其二為照明光源關(guān)閉模式下的熒光圖像。熒光內(nèi)窺鏡最終目標(biāo)是在正常光源照明時，將被熒光標(biāo)記的待切除部分的凸顯出來，提高手術(shù)的指導(dǎo)性和指向性，以達(dá)到提升切除手術(shù)精準(zhǔn)度的目的1。如何高速準(zhǔn)確的呈現(xiàn)白光和熒光圖像的融合逐漸成為研究的熱點(diǎn)以及熒光內(nèi)窺鏡的核心技術(shù)。
圖像融合方法一般分為像素級、特征級和決策級三個融合級別。基于像素級融合的方法是圖像融合領(lǐng)域的主流研究趨勢，因?yàn)樗谌诤蠄D像中造成的偽影是最小的，其像素由一組圖像像素或其他形式的圖像參數(shù)在最低物理級確定的17。
圖像融合的評價方式可大體上分為主觀評價和客觀評價。其中主觀評價是基于人眼來評估融合后的圖像，這種方式比較適用于圖像上表示明顯的信息，可以進(jìn)行快速、直觀的進(jìn)行評判，但是由于觀察者的不同，會產(chǎn)生的圖像質(zhì)量評價的不同，所以通常將主觀評價與客觀評價結(jié)合起來對一幅圖像的質(zhì)量進(jìn)行評價。
客觀評價常見參考指標(biāo)有如下幾種18：
1)信息熵（IE）：圖像包含平均信息量的度量，熵值與融合的效果成正相關(guān)，值越高表示得到的融合圖像中的信息量越大，融合的質(zhì)量越好；
2)峰值信噪比（PSNR）：峰值功率與噪聲的比值。PSNR值越大，證明融合后的圖像與源圖像越接近、失真越小；
3)互信息（MI）：度量融合圖像含有源圖像信息量多少的指標(biāo)。MI值越大表示融合圖像繼承的信息越多，融合效果越好；
4)視覺信息保真度（VIF）：衡量的是融合圖像的信息保真度，與人類的視覺系統(tǒng)是保持一致，VIF 計(jì)算融合圖像與源圖像之間的失真程度，能準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)融合圖像中存在的畸變和改進(jìn)。VIF 值越大，融合效果越好；
5)平均梯度（AG）：用于衡量圖像的清晰程度，AG的值越大，圖像的清晰度越好，說明融合的質(zhì)量越好；
6)邊緣保持量：用于度量從源圖像中傳輸?shù)倪吘壭畔⒘?。并在此基礎(chǔ)上假設(shè)融合圖像保留了源圖像中的邊緣信息，值越大則梯度丟失越小，融合圖像保留的梯度信息越多。
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