作為一名藥物研發(fā)分析工作人員，相信你在平時(shí)工作中經(jīng)常會(huì)遇到一些色譜峰前延、峰展寬、甚至峰分叉現(xiàn)象。導(dǎo)致峰形不好的原因有很多，其中一種可能的原因就是溶劑效應(yīng)造成。
從概念上講溶劑效應(yīng)亦稱“溶劑化作用”。指液相反應(yīng)中，溶劑的物理和化學(xué)性質(zhì)影響反應(yīng)平衡和反應(yīng)速度的效應(yīng)。通俗的講也就是樣品溶解所使用的溶劑在液相色譜系統(tǒng)造成的一種效應(yīng)。最本質(zhì)的原因就是流動(dòng)相和稀釋液的某種不匹配導(dǎo)致。一般會(huì)造成色譜峰展寬、分叉、肩峰、保留時(shí)間漂移、峰面積變化等現(xiàn)象。
一般稀釋液和流動(dòng)相越不一致，樣品濃度約高，進(jìn)樣體積越大，越容易發(fā)生溶劑效應(yīng)問(wèn)題，所以檢查是否為溶劑效應(yīng)最簡(jiǎn)單的方法就是降低進(jìn)樣體積重復(fù)進(jìn)樣一針，如果峰形變好則為溶劑效應(yīng)導(dǎo)致。
今天和大家一起分享下我遇到的溶劑效應(yīng)的五個(gè)典型案例，包括了色譜峰展寬、分叉、肩峰、保留時(shí)間漂移、峰面積變化現(xiàn)象，希望能夠引起大家在遇到類似問(wèn)題時(shí)能聯(lián)想到是溶劑效應(yīng)原因造成的。
案例1：常規(guī)性質(zhì)的溶劑效應(yīng)：稀釋液極性強(qiáng)度小于流動(dòng)相。
主要色譜條件：
圖1:稀釋液為80%乙腈；雜質(zhì)出峰時(shí)流動(dòng)相比例約為50%乙腈，進(jìn)樣20μl 圖2:進(jìn)樣5μl，其他同圖1條件。
從圖中看出三個(gè)雜質(zhì)峰均出現(xiàn)不同程度的前延現(xiàn)象，且從左到右三個(gè)峰的前延效果依次減弱，再根據(jù)所采用稀釋液和流動(dòng)相，基本就能判斷出是因?yàn)橄♂屢翰黄ヅ鋵?dǎo)致的。當(dāng)進(jìn)樣體積減小，峰型就變好，則肯定就是容積效應(yīng)問(wèn)題。此時(shí)如果還想獲得一個(gè)好的峰型只要降低進(jìn)樣體積或者更換低比例有機(jī)相稀釋液即可。
案例2：稀釋液極性強(qiáng)度大于流動(dòng)相極性造成的溶劑效應(yīng)
主要色譜條件：
圖1：10%甲醇為稀釋液；標(biāo)計(jì)的雜質(zhì)出峰時(shí)流動(dòng)相比例約為99%甲醇; 圖2：更改稀釋液為30%甲醇，其他同圖1條件。
從圖中可以看出標(biāo)記峰的峰形出現(xiàn)前沿現(xiàn)象（其它幾個(gè)峰也有一些），特別是第一個(gè)峰，效果最為明顯。這種溶劑效應(yīng)平時(shí)不多見(jiàn)，開(kāi)始我們遇到該現(xiàn)象時(shí)并沒(méi)有立刻聯(lián)想到溶劑稀釋液的問(wèn)題，因稀釋液極性已經(jīng)很大了，開(kāi)始考慮為色譜柱使用時(shí)間太長(zhǎng)了導(dǎo)致，后來(lái)更換色譜柱也是同樣的效果。偶然一次用錯(cuò)了稀釋液卻給出了很好的峰形，后來(lái)經(jīng)測(cè)試進(jìn)行降低進(jìn)樣體積確實(shí)能改善峰形。所以有些化合物即使在稀釋液極性強(qiáng)度大于流動(dòng)相極性時(shí)也會(huì)產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，造成峰形前延的問(wèn)題。
案例3：稀釋液中的某種基質(zhì)導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)
圖1：對(duì)照品溶液; 圖2：對(duì)照品+供試品溶液
在該案例中，兩個(gè)樣品的檢測(cè)條件均相同，但進(jìn)樣對(duì)照品溶液每個(gè)雜質(zhì)出峰都沒(méi)有問(wèn)題，而加標(biāo)供試品進(jìn)樣后，前面兩個(gè)化合物的色譜峰就變差，第一個(gè)變矮胖，第二個(gè)更明顯直接變肩峰。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)主要原因?yàn)榕渲霉┰嚻窛舛忍?，制劑中含有一種脂溶性的輔料，導(dǎo)致稀釋液的極性發(fā)生了變化，造成了溶劑效應(yīng)問(wèn)題。后將進(jìn)樣體積降低后峰形變好。
案例4：溶劑效應(yīng)導(dǎo)致雜質(zhì)的峰面積變化問(wèn)題
圖1：化合物的峰面積為14.470；稀釋液為25%乙腈; 圖2：化合物的峰面積為11.550；稀釋液為75%乙腈; 圖3：稀釋液為75%乙腈，提高化合物的濃度。
在進(jìn)行一個(gè)項(xiàng)目研究時(shí)，發(fā)現(xiàn)將稀釋液更改后化合物的峰面積卻發(fā)生了變化（在同一臺(tái)液相檢測(cè)）；而重新配置樣品重復(fù)性較好。經(jīng)對(duì)比化合物的峰形，圖1峰形較好，圖2峰形變矮。后將樣品濃度提高，使用75%乙腈為稀釋液測(cè)定發(fā)現(xiàn)峰形前延更厲害（圖3）。所以推斷峰面積變化的原因?yàn)榉暹w延導(dǎo)致積分不準(zhǔn)確，此也為溶劑效應(yīng)導(dǎo)致的問(wèn)題。
案例5：溶劑效應(yīng)導(dǎo)致雜質(zhì)峰保留時(shí)間漂移問(wèn)題
圖1：供試品酸破壞溶液，樣品先加50%乙腈2ml使溶解，加1M鹽酸2ml破壞，后加1M氫氧化鈉2ml中和，用50%乙腈定容（理論推斷破壞雜質(zhì)2.605min應(yīng)為雜質(zhì)A）。圖2：雜質(zhì)A對(duì)照品溶液：直接用50%乙腈溶解; 圖3：雜質(zhì)A對(duì)照品溶液，按供試品破壞的方式配制。圖4：圖1-3重疊效果。
該案例發(fā)現(xiàn)來(lái)源于一個(gè)破壞雜質(zhì)的定位，根據(jù)API的結(jié)構(gòu)推斷在酸性條件應(yīng)該破壞出雜質(zhì)A，但是在使用雜質(zhì)A進(jìn)行定位時(shí)保留時(shí)間一直對(duì)不上，總是有些差別(圖1和圖2)，因其出峰較早，所以保留時(shí)間的差異算是比較大了。后將雜質(zhì)A使用API破壞方式相同的步驟進(jìn)行操作，結(jié)果其保留時(shí)間和API破壞的峰完美重合（圖3和4）。經(jīng)對(duì)比分析雜質(zhì)A保留時(shí)間差異主要為兩種稀釋液的微弱不同導(dǎo)致。該案例展現(xiàn)為稀釋液不一致導(dǎo)致了保留化合物保留時(shí)間改變，也是一種溶劑效應(yīng)的范疇。
以上為大家分享的5個(gè)關(guān)于溶劑效應(yīng)的案例，每個(gè)情況雖有不同，但最終原因都?xì)w因于稀釋液導(dǎo)致的溶劑效應(yīng)問(wèn)題。希望能夠?qū)Υ蠹以谠囼?yàn)過(guò)程中出現(xiàn)類似問(wèn)題時(shí)提供一些幫助。
參考文獻(xiàn)：
[1] ZMJ.高效液相色譜中溶劑效應(yīng)理論.藥事縱橫.
[2]彩云.一篇長(zhǎng)文讓您完全理解液相色譜中的溶劑效應(yīng).色譜與質(zhì)譜.。
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