骨是人體不可分割的一部分，通過自身不斷的自修復維持骨量和承重特性。然而，骨的自我修復受制于缺損范圍及其生理狀況。骨重建是一個復雜的生理過程，涉及多種細胞類型和各種生理因素的相互作用，需要多方協(xié)同作用維持骨組織的完整性。相較于傳統(tǒng)的治療方法，骨組織工程成為治療骨缺損的一種有效策略，但是構(gòu)建具有結(jié)構(gòu)支撐和再生微環(huán)境適配的骨修復材料仍然面臨巨大的挑戰(zhàn)。
具有多孔的微/納纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)生物活性支架因其類似于細胞外基質(zhì)（ECM），能夠促進細胞粘附和增殖等行為，有利于支架與組織的整合，近年來受到研究者們的青睞。與其他支架制備技術(shù)相比，3D打印技術(shù)在制備幾何形狀可定制、孔徑可控的三維支架方面表現(xiàn)出了優(yōu)勢，然而三維支架較低的力學強度和較弱的成骨能力將限制其在骨修復中的實際應用。理想的人工骨修復材料應該滿足以下幾個方面的需求：（1）制備的支架材料具有與缺損部位相匹配的個性化形狀和ECM樣微結(jié)構(gòu)，利于營養(yǎng)物質(zhì)輸送和骨組織生長；（2）具有合適的力學性能和降解速率，為骨重建提供較好的結(jié)構(gòu)支撐；（3）具有足夠的血管生成和成骨活性，加速血管化骨再生。
近期，東華大學何創(chuàng)龍教授團隊在前期工作基礎(chǔ)上（Adv. Funct. Mater., 2022, 32(20): 2200011; Bioact. Mater., 2021, 6(10): 3254-3268；Biomater. Sci., 2021, 9(7): 2631-2646; Chem. Eng. J., 2019, 362: 269-279）, 受“花圃”結(jié)構(gòu)和花卉通過花粉吸引昆蟲（例如蜜蜂和蝴蝶）特征的啟發(fā)，結(jié)合3D打印和靜電紡技術(shù)，構(gòu)建了以3D打印支架為框架和靜電紡納米纖維為填充物的生物活性支架（DMSNs/SrHA/PGP），兼顧支架的多級微結(jié)構(gòu)、力學強度和生物活性。利用3D打印微絲和納米纖維分別裝載摻鍶羥基磷灰石（SrHA）和載有二甲基草酰甘氨酸的介孔硅納米粒子（DMSNs），通過兩者差異的降解速率實現(xiàn)DMOG和Sr離子的順序釋放，促進細胞的遷移和分化，以達到及時的血管化和穩(wěn)定的骨形成目的，從而促進骨缺損修復（圖1）。
圖1 DMSNs/SrHA/PGP支架的制備與引導骨組織再生示意圖。
SEM與TEM圖片顯示，SrHA和DMSNs可以均勻地分散在3D打印微絲和納米纖維中（圖2）。從支架的宏觀形貌可見，納米短纖維與3D打印支架的復合具有較好的適用性。同時，納米纖維穿插在3D打印支架的間隙中，其微結(jié)構(gòu)致密程度與納米纖維濃度正相關(guān)?？傊m宜的納米纖維濃度（2 wt%）能夠為細胞遷移和向內(nèi)爬行提供結(jié)構(gòu)支持。
圖2 （A）不同納米纖維含量復合支架的制備示意圖；（B）復合支架的宏觀圖片；（C-F）3D 打印微絲與電紡纖維的SEM 與TEM圖；（G-I）不同納米纖維含量（1-4 wt%）復合支架的SEM圖。
因納米纖維成分為明膠和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）復合物以及疏松的多孔結(jié)構(gòu)，所有納米纖維填充的支架均表現(xiàn)出超好的親水性（圖3）。力學性能測試結(jié)果顯示，復合支架具有較高的壓縮強度（壓縮模量為29.85 ± 4.75 MPa）。降解實驗表明，12周內(nèi)DMSNs/SrHA/PGP復合支架中的納米纖維降解較快，而SrHA@PCL框架沒有明顯的降解。此外，DMOG呈現(xiàn)早期的快速釋放，而Sr離子表現(xiàn)明顯的持續(xù)釋放，這種釋放模式有利于刺激早期血管新生和隨后的骨生成。
圖3 （A-B）支架的元素分析；（C）支架的親水性；（D-E）支架的力學性能；（F-G）支架的降解性能；（H-I）DMOG和Sr離子的釋放。
快速的血管生成能夠為骨再生過程提供足夠的營養(yǎng)供應，促進新骨的形成和深層骨組織的存活。隨后，通過體內(nèi)包埋實驗研究支架的促血管生成能力（圖4）。實驗結(jié)果顯示小鼠皮下植入4周后，支架內(nèi)部呈現(xiàn)明顯的組織長入，生成了微血管網(wǎng)絡(luò)。其中，DMSNs/SrHA/PGP支架中觀察到大量的微血管，也具有更高的成血管因子表達。
圖4 （A）復合支架的小鼠包埋與評價示意圖；（B-C）血管灌注的Micro-CT 成像與定量分析；（D-E）；CD31表達的熒光圖片與定量分析；（F-G）HIF-1α表達的熒光圖片與定量分析。
在大鼠顱骨構(gòu)建骨缺損模型，通過micro-CT分析和組織切片染色評價支架的成骨性能（圖5）。研究結(jié)果顯示，DMSNs/SrHA/PGP支架組表現(xiàn)出更多的新骨生成。由于Sr離子和DMOG可協(xié)同促進體內(nèi)骨再生，因此DMSNs/SrHA@PGP支架具有更好的骨再生效果。
圖5 （A）復合支架的大鼠顱骨缺損修復示意圖；（B-D）體內(nèi)骨再生的micro-CT重建圖片與骨密度和骨體積的定量分析；（E）H&E和Masson染色圖片。
為了評估復合支架在顱骨缺損模型中的促血管化能力，通過CD31和α-SMA的免疫熒光染色進行觀察。研究發(fā)現(xiàn)，DMSNs/SrHA/PGP支架組能觀察到更多的CD31和α-SMA表達，表明誘導了更多血管的形成。然后，DMSNs/SrHA@PGP支架組中的OCN表達也顯示了更強的熒光信號。此外，通過CD68和CD163的免疫熒光染色評價支架的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示DMSNs/SrHA@PGP支架組中CD163+/CD68+巨噬細胞的百分比高于其他組，表明該支架能夠調(diào)節(jié)巨噬細胞表型促進骨組織再生。
圖6 （A）CD31、α-SMA和OCN表達的熒光圖片；（B）CD68和CD163表達的熒光圖片；（C-F）CD31、α-SMA、OCN和CD163+/CD68+的定量分析。
在本研究中，利用3D打印SrHA@PCL支架作為框架結(jié)構(gòu)，賦予了復合支架較高的力學性能。復合支架內(nèi)填充的多孔納米纖維網(wǎng)絡(luò)不僅促進營養(yǎng)物質(zhì)運輸和組織長入，還通過釋放DOMG促進血管形成。此外，結(jié)合納米纖維的較快降解和3D打印微絲的緩慢降解行為，實現(xiàn)了DMOG和Sr離子的可控釋放，促進了血管生成和成骨的耦合。綜上所述，本研究制備的DMSNs/SrHA@PGP支架可以促進快速的組織浸潤和引導血管化骨再生，同時為構(gòu)建與成骨微環(huán)境適配的仿生骨支架提供了一種新策略。
該工作以“Flowerbed-Inspired Biomimetic Scaffold with Rapid Internal Tissue Infiltration and Vascularization Capacity for Bone Repair”為題發(fā)表在《ACS Nano》期刊上，論文的通訊作者為東華大學何創(chuàng)龍教授、上海市第九民醫(yī)院王金武主任醫(yī)師和上海市第一人民醫(yī)院馬小軍副主任醫(yī)師，第一作者為東華大學周小軍博士。該工作得到國家自然科學基金、上海市科委等項目的資助。
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