近期，復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院董健教授、周曉崗副教授和江立波副研究員在科愛(ài)出版創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上發(fā)表論著文章：壓阻式MXene/絲蛋白復(fù)合水凝膠通過(guò)重建電微環(huán)境加速骨再生。研究者設(shè)計(jì)了一種負(fù)載MXene納米片的絲蛋白（RSF）復(fù)合水凝膠。證明ES可通過(guò)激活Ca2+/CALM信號(hào)通路并誘導(dǎo)M2型巨噬細(xì)胞的極化促進(jìn)骨再生與血管重建。
研究?jī)?nèi)容簡(jiǎn)介
電活動(dòng)是人體主要的生理活動(dòng)之一，電微環(huán)境被認(rèn)為與組織再生、肌肉收縮以及胚胎生成等多項(xiàng)生理活動(dòng)密切相關(guān)。外源性電刺激（ES）可影響骨電微環(huán)境，因此被認(rèn)為可調(diào)節(jié)成骨相關(guān)細(xì)胞的功能。既往研究已成功將ES用于難治性骨折以及骨不連等骨組織再生工程的輔助組織治療中。然而，受限于骨微環(huán)境的復(fù)雜性，ES促進(jìn)骨再生的機(jī)制尚不明確。水凝膠是兼具各項(xiàng)生物特性的柔性支架，絲蛋白水凝膠除了具有以上特性之外，還具有機(jī)械強(qiáng)度高、天然抗菌和促進(jìn)成骨的優(yōu)點(diǎn)。MXene是一種新穎的二維（2D）過(guò)渡金屬配合物納米材料，其具有良好的壓電效應(yīng)、親水性和豐富的化學(xué)性質(zhì)。相較于碳納米管、PVDF等其他導(dǎo)電納米材料具有更容易被分散到聚合物網(wǎng)絡(luò)中和在體內(nèi)環(huán)境下不易因降解和受潮導(dǎo)致電導(dǎo)率下降的優(yōu)點(diǎn)?；谝陨嫌^點(diǎn)，研究者設(shè)計(jì)了由辣根過(guò)氧化物酶（HRP）/過(guò)氧化氫（H2O2）催化交聯(lián)的RSF水凝膠生物封裝MXene納米片，合成一種具有壓電效應(yīng)的生物電活性復(fù)合水凝膠MXene/RSF。在體外評(píng)估其細(xì)胞相容性、電導(dǎo)率、成骨誘導(dǎo)特性、骨免疫調(diào)節(jié)能力、血管生成能力并探索ES刺激成骨分化的機(jī)制。在動(dòng)物體內(nèi)評(píng)估其促進(jìn)骨再生能力、血管重建能力與骨免疫調(diào)節(jié)能力，證明該導(dǎo)電水凝膠在臨床成骨修復(fù)中的應(yīng)用潛力。
圖1：多功能電活性復(fù)合水凝膠的制備與應(yīng)用于骨缺損多樣化治療的示意圖。（I）合成MXene/RSF的工藝流程。（II）MXene/RSF重建骨電微環(huán)境加速骨再生的概念圖與機(jī)制。
1. MXene/RSF的合成與表征結(jié)果
研究者合成具有高機(jī)械強(qiáng)度的雙交聯(lián)復(fù)合水凝膠MXene/RSF，MXene表面富含羥基，與RSF之間可形成廣泛的氫鍵。在圖2C中可以看到隨著MXene濃度升高，樣品的存儲(chǔ)模量G’和損耗模量G’’迅速提升并達(dá)到平臺(tái)期，溶液更早地發(fā)生溶膠-凝膠轉(zhuǎn)換。SEM表征結(jié)果顯示隨著MXene的加入，水凝膠表面的孔洞分布更加密集且排列更加規(guī)律，見(jiàn)圖2D。以上結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞在水凝膠表面的黏附與遷移。對(duì)MXene/RSF水凝膠的冷凍SEM表征與前文結(jié)果一致。（見(jiàn)圖2E）
圖2：MXene/RSF的成膠過(guò)程與形態(tài)學(xué)表征結(jié)果。（A）MXene/RSF溶液和MXene/RSF水凝膠的數(shù)碼照片。（B）隨MXene濃度變化不同水凝膠組別的成膠時(shí)間。（C）不同水凝膠組別成膠過(guò)程中的流體力學(xué)變化結(jié)果。（D）不同水凝膠組別的斷面SEM圖像。（E）MXene/RSF水凝膠的SEM-EDS結(jié)果。（F）RSF和0.4&MXene/RSF水凝膠的冷凍SEM結(jié)果。
對(duì)MXene/RSF水凝膠的FTIR表征結(jié)果如圖3A所示。1640cm-1處的特征峰對(duì)應(yīng)了其內(nèi)部所含的β折疊結(jié)構(gòu)，且隨著MXene濃度提升，峰值不斷增加，與前文實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。圖3C,D,E,F展示MXene/RSF的機(jī)械強(qiáng)度隨MXene濃度變化的結(jié)果。隨著MXene濃度升高，水凝膠的彈性下降。
水凝膠的導(dǎo)電性是刺激成骨相關(guān)細(xì)胞活性的關(guān)鍵，因此研究者表征了MXene/RSF的導(dǎo)電性。圖3G,H展示隨著MXene濃度提升，水凝膠的電導(dǎo)率提升至4×10-4S/cm點(diǎn)亮LED二極管。圖3I,J顯示水凝膠內(nèi)部MXene均勻分布，使其擁有良好的導(dǎo)電性且具有實(shí)時(shí)電阻響應(yīng)性。最后，研究者探索了MXene/RSF應(yīng)用于穿戴式動(dòng)態(tài)傳感器的潛力。圖3K,L,M展示MXene/RSF貼附到人體皮膚表面后，檢測(cè)到的包括手指彎曲、握拳和按壓在內(nèi)的細(xì)微動(dòng)作。
圖3：MXene/RSF水凝膠的化學(xué)結(jié)構(gòu)和多功能特性。（A）MXene/RSF其結(jié)構(gòu)、組份的FTIR結(jié)果。（B）不同對(duì)照組的XRD結(jié)果。（C,D）不同對(duì)照組的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線和彈性模量。（E,F)不同對(duì)照組的壓縮應(yīng)力-應(yīng)變曲線和壓縮模量。（G）RSF和MXene/RSF水凝膠通電點(diǎn)亮LED二極管的數(shù)碼圖像。（H）不同濃度MXene的水凝膠電導(dǎo)率。（I,J) MXene/RSF的分離-接觸電導(dǎo)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的電阻變化。（K,L,M) MXene/RSF水凝膠用于動(dòng)態(tài)傳感器的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
2. MXene/RSF的體外生物特性
2.1 MXene/RSF水凝膠聯(lián)合ES促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞極化
圖4A,B分別說(shuō)明0.4%MXene/RSF和ES均可通過(guò)上調(diào)BMSCs內(nèi)堿性磷酸（ALP）的表達(dá)和胞內(nèi)外鈣顆粒的沉積促進(jìn)BMSCs各階段向成骨相關(guān)細(xì)胞分化。圖4C,D,E,F說(shuō)明ES和0.4%MXene/RSF可通過(guò)上調(diào)BMSCs內(nèi)RUNX-2和Col-1的蛋白表達(dá)以促進(jìn)其向成骨相關(guān)細(xì)胞分化，PCR結(jié)果與之相互印證。（見(jiàn)圖4G）
巨噬細(xì)胞不同表型的極化調(diào)控了骨免疫微環(huán)境，并最終調(diào)節(jié)骨組織再生與重塑。其中M1型巨噬細(xì)胞促進(jìn)局部炎癥，而M2型巨噬細(xì)胞則促進(jìn)局部傷口愈合。M2型巨噬細(xì)胞極化的標(biāo)志物為Arginase-1和CD206。作者利用流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)0.4%MXene/RSF+ES組中巨噬細(xì)胞內(nèi)M2表型占比顯著提升，而單純MXene組的M2表型巨噬細(xì)胞占比未出現(xiàn)顯著改變，說(shuō)明主要是ES促進(jìn)了巨噬細(xì)胞向M2表型極化，見(jiàn)圖4H。圖4I中對(duì)Arginase-1的免疫熒光染色結(jié)果也印證了這一點(diǎn)。另外，研究者還設(shè)計(jì)了M2型巨噬細(xì)胞與BMSCs共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)，用于評(píng)估M2巨噬細(xì)胞對(duì)BMSCs的作用。如圖4J,K所示，M2型巨噬細(xì)胞顯著促進(jìn)了BMSCs中的ALP表達(dá)。
圖4：各對(duì)照組水凝膠對(duì)BMSCs向成骨細(xì)胞分化的作用以及ES對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞極化的免疫調(diào)節(jié)作用。（A,B）第7天的ALP染色和第21天的ARS染色結(jié)果。（C,D,E,F）第7天BMSCs內(nèi)RUNX-2和Col-1的蛋白免疫熒光染色和定量分析結(jié)果。（G）OCN,RUNX-2,Col-1和ALP的PCR結(jié)果。（H）各對(duì)照組巨噬細(xì)胞的CD206+F4/80流式細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。（I）巨噬細(xì)胞內(nèi)Arginase-1的免疫熒光染色結(jié)果。（J）M2型巨噬細(xì)胞和BMSCs共培養(yǎng)的示意圖。（K）使用RAW264.7細(xì)胞的條件培養(yǎng)基孵育BMSCs7天后的ALP染色結(jié)果。
3. MXene/RSF聯(lián)合ES用于體內(nèi)骨修復(fù)
研究者構(gòu)建了SD大鼠的顱骨骨缺損模型以評(píng)估電活性復(fù)合水凝膠MXene/RSF促進(jìn)體內(nèi)骨再生和血管重建的作用，見(jiàn)圖5A。圖5B,C,D,E,F顯示0.4%MXene/RSF+ES組在實(shí)驗(yàn)期間骨缺損邊緣新生骨的形成最為顯著，松質(zhì)骨修復(fù)指標(biāo)亦與之相符。同時(shí)，其血管重建情況最為理想，見(jiàn)圖5G。
圖5：MXene/RSF水凝膠聯(lián)合ES加速骨再生與血管重建的影像學(xué)結(jié)果。（A）SD大鼠顱骨骨缺損模型的建立過(guò)程與結(jié)果。（B）術(shù)后第6周與第12周各對(duì)照組顱骨缺損的Micro-CT圖像結(jié)果。（C,D,E,F）基于Micro-CT的各對(duì)照組松質(zhì)骨骨小梁分析結(jié)果。（D）術(shù)后第12周各對(duì)照組血管的三維重建結(jié)果圖像。
綜上，作者設(shè)計(jì)了一種基于絲蛋白負(fù)載MXene納米顆粒的的生物電活性復(fù)合水凝膠，其可以通過(guò)聯(lián)合外部電刺激激活Ca2+/CALM信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs分化并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化調(diào)節(jié)局部免疫微環(huán)境，從而有利于骨再生。該材料為難治性骨缺損提供了一種潛在的臨床治療策略。
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