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所謂藥典方法，顧名思義，藥典專論所收載的方法，但是否每個人都知道，藥典方法考慮到各個實(shí)驗(yàn)室的差異，有一定的可調(diào)范圍。下面我們具體的來探討一下這個問題吧!

 

中國藥典2020規(guī)定

 

0512高效液相色譜法規(guī)定如下：

品種正文項(xiàng)下規(guī)定的色譜條件（參數(shù)）除填充劑種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑與長度、填充劑粒徑、流動相流速、流動相組分比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗(yàn)的要求。調(diào)整流動相組分比例時，當(dāng)小比例組分的百分比例X小于33%時，允許改變范圍為0.7X?1.3X;當(dāng)X大于33%時，允許改變范圍為X—10%?X+10%。

 

由上文可知，中國藥典專論方法除填充劑種類、流動相組分（比例調(diào)整在規(guī)定范圍內(nèi)）、檢測器類型不得改變外，其他條件改變了，還是認(rèn)為是藥典方法。但中國藥典沒有規(guī)定方法確認(rèn)之說，所以，即使是中國藥典方法，也是應(yīng)該按分析方法驗(yàn)證的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行全套的方法驗(yàn)證。

 

美國藥典規(guī)定

 

USP43<621>CHROMATOGRAPHY規(guī)定如下：

為符合系統(tǒng)適用性的要求而調(diào)整的操作條件是允許的，除非專論項(xiàng)下另有規(guī)定，下面為所列的最大的可調(diào)范圍，這些調(diào)整需要額外的確認(rèn)數(shù)據(jù)。為確認(rèn)新條件對方法的適用性，評估調(diào)整對相關(guān)分析性能特征存在的潛在影響。多條件的調(diào)整，將對系統(tǒng)性能產(chǎn)生累積影響，實(shí)施前需仔細(xì)考慮。

1、流動相緩沖液的pH（HPLC）:±0.2單位以內(nèi)或規(guī)定范圍以內(nèi)調(diào)節(jié)，適用梯度及等度。

2、流動相緩沖液鹽濃度（HPLC）：±10%（pH允許情況下），適用梯度及等度。

 

3、流動相中組分比例（HPLC）：組分比例≤50%的組分可以相對調(diào)節(jié)±30%，但是任意一組分比例的調(diào)節(jié)不應(yīng)超過±10%（相對于總的流動相），含三組分的流動相的調(diào)節(jié)可以分組分進(jìn)行，含雙組分的流動相的調(diào)節(jié)可在最小的組分進(jìn)行，雙組份和三組分的調(diào)節(jié)實(shí)例如下：

雙組分：例如流動相50:50，其中一組分50%的30%是15%，但是它超過了占總體比例±10%的規(guī)定，所以這個流動相比例的調(diào)節(jié)范圍應(yīng)以±10%為限，可以在不超過40:60~60:40的范圍之間調(diào)節(jié)。再例如流動相比例為2:98，其中小組分2%的30%是0.6%，這個值不超過占總體比例±10%的規(guī)定，此流動相的比例可以在不超過1.4:98.6~2.6:97.4的范圍之間調(diào)節(jié)。

 

三組分：例如流動相60:35:5，它的次組分35%的30%是10.5%，但是它超過了占總體比例±10%的規(guī)定，所以這個流動相比例中的次組分的調(diào)節(jié)范圍應(yīng)以±10%為限。對于最小組分5%的30%是1.5%?？梢栽诓怀^50:45:5~70:25:5或58.5:35:6.5~61.5:35:3.5的范圍之間調(diào)節(jié)。

 

4、紫外檢測器的波長（HPLC）:專論中規(guī)定的檢測波長不允許改變，檢測器供應(yīng)商的程序或另一個驗(yàn)證程序來說明，波長檢測誤差，最多不得超過±3nm。

 

5、固定相

色譜柱長度(GC):可以在±70%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

色譜柱長度(HPLC):見粒徑項(xiàng)下。

色譜柱內(nèi)徑(HPLC):如果線速度保持恒定，可以調(diào)整。見HPLC流速。

色譜柱內(nèi)徑(GC):最大可調(diào)整至±50%。

膜厚(毛細(xì)管柱GC):最大可在−50%至100%調(diào)整。

 

6、粒徑(HPLC):等度洗脫：粒徑和柱長均可以修改，但柱長（L）與粒徑（dp）的比值（L/dp）恒定或在規(guī)定柱長與粒徑的比值的-25%~+50%范圍內(nèi)?；蛘撸▽τ趯⒘６日{(diào)節(jié)應(yīng)用于表面多孔顆粒時），其它柱長（L）和粒度（dp）的柱子可以使用，但理論塔板數(shù)（N）應(yīng)在規(guī)定柱的-25%~+50%范圍內(nèi)。如果調(diào)節(jié)導(dǎo)致更高的理論塔板數(shù)時應(yīng)注意，這樣將產(chǎn)生更小的峰體積，應(yīng)通過縮小額外柱外峰拓寬的因素調(diào)整，例如儀器的管路、檢測池的體積、采樣速率和進(jìn)樣體積。當(dāng)專論中未規(guī)定粒度時，該比值應(yīng)采用規(guī)定柱的最大粒度計(jì)算。

 

7、粒徑(GC):如果色譜圖的符合系統(tǒng)適用性要求以及粒徑范圍比相同，粒度大小可以從大變小或從小變大，粒徑范圍比的定義是最大粒度直徑除以最小粒度直徑。

 

8、流速(GC):流速可以最大在±50%調(diào)整。

 

9、流速(HPLC)：當(dāng)粒度改變時，流速也許需要調(diào)整，因?yàn)闉檫_(dá)到相同的性能，小粒度的柱子需要更高的線速度（測量通過較少塔板高度），流速、柱內(nèi)徑、粒度通過下面公式換算。

F2=F1×[(dc22×dp1)/(dc12×dp2)]

其中：

 

 

對于等度洗脫，如果粒度從≥3μm變化到＜3μm時，將增加線速度（通過調(diào)整流速），如果柱效不下跌20%以上，相同地，如果粒度從＜3μm變化到≥3μm時，應(yīng)減少線速度（流速）來避免柱效降低20%以上。梯度洗脫：流速、柱內(nèi)徑、粒度將不允許調(diào)整。另外，流速可以在±50%調(diào)整。（只適用于等度洗脫）

 

歐洲藥典10.0規(guī)定

 

EP10.0  2.2.46Chromatographic Separation Techniques規(guī)定如下：

1、液相色譜-等度洗脫：小組分的數(shù)量可以在相對±30%或絕對±2%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，兩者取其大。

（2）流動相中水相組分的pH：除非專論中另有規(guī)定，用于配制流動相的pH可以在規(guī)定的值或范圍的±0.2以內(nèi)調(diào)節(jié)。如果待測品為非電離物質(zhì)（中性物質(zhì)），pH可在±1.0范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

（3）流動相中緩沖液鹽濃度：用于配制流動相的含水緩沖液的鹽的濃度可在±10%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

（4）流速：一般調(diào)節(jié)范圍為±50%，若柱尺寸改變了，流速可以更大范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，具體可按下述公式來計(jì)算。

 

（5）色譜柱參數(shù)：

固定相：固定相的屬性不能改變（例如：不能用C8來代替C18）；

粒徑：最多可減小50%，不允許增加。

色譜柱長度:可以±70%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

色譜柱內(nèi)徑：可在±25%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

當(dāng)柱的尺寸改變時，流速通過下面公式進(jìn)行調(diào)節(jié)。

F2=F1×[(l2×d22)/(l1×d12)]其中：

 

 

（6）柱溫：除另有規(guī)定，可以在規(guī)定柱溫±10℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，。

（7）檢測波長：不允許改變。

（8）進(jìn)樣體積：若待檢峰的靈敏度和重復(fù)性好的話可以減小，不允許提高。

 

 

2、液相色譜-梯度洗脫梯度洗脫的液相條件調(diào)節(jié)需比等度洗脫的更加慎重。

流動相的組成/梯度洗脫可以在符合下述條件的前提下進(jìn)行小范圍的調(diào)節(jié)：滿足系統(tǒng)適應(yīng)性的條件；主峰的出峰時間在原定保留時間的±15%以內(nèi)；流動相中最終組分的洗脫能力的強(qiáng)度不得弱于原規(guī)定組分；如果系統(tǒng)適應(yīng)性的條件達(dá)不到，則通常首選考慮滯留體積或更換柱子。

（1）滯留體積（死體積）：儀器的結(jié)構(gòu)將會大大的改變分離度、保留時間、相對保留時間，如果這些發(fā)生，是由于滯留體積過多。專論中通常在梯度洗脫時先進(jìn)行等度洗脫?？紤]到方法開發(fā)系統(tǒng)和實(shí)際系統(tǒng)的滯留體積的不同，所以梯度洗脫的時間應(yīng)該足夠。所以使用者在進(jìn)行方法確認(rèn)時應(yīng)確認(rèn)等度洗脫的時間。如果洗脫時的滯留體積在專論中有規(guī)定，則開始洗脫的時間點(diǎn)（tmin）應(yīng)該被調(diào)節(jié)時間點(diǎn)(tcmin)替代。用下面公式計(jì)算

 

式中：D：滯留體積，ml；D0：方法開發(fā)時的滯留體積，ml；F：流速ml/min。如果方法的驗(yàn)證沒有包括該步驟，用于上述目的的等度的描述可以被省略。

（2）流動相中緩沖液的pH：不允許調(diào)節(jié)。

（3）流動相中緩沖液鹽的濃度：不允許調(diào)節(jié)。

（4）流速：當(dāng)柱子的內(nèi)徑改變時，調(diào)節(jié)是可以接受的，具體見流速公式。

（5）柱參數(shù)

固定相：固定相的屬性不能改變（例如：不能用C8來代替C18）；

粒徑，不允許調(diào)節(jié)。

色譜柱長度：長度可以±70%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

內(nèi)徑：可在±25%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

當(dāng)柱的尺寸改變時，流速按照下面的公式進(jìn)行計(jì)算并調(diào)節(jié)。

F2=F1×[(l2×d22)/(l1×d12)]其中：

 

F1	=專論中規(guī)定的流速，ml/min；
F2	=調(diào)整后的流速，ml/min；
l1	=專論中規(guī)定的柱長，mm；
l2	=使用的柱子的柱長，mm；
d1	=專論中規(guī)定的柱內(nèi)徑，mm；
d2	=使用的柱子的內(nèi)徑，mm。

（6）柱溫：除另有規(guī)定外，溫度可在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定溫度±5℃范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

（7）檢測波長：不允許改變。

（8）進(jìn)樣體積：若待檢峰的靈敏度和重復(fù)性可滿足的話可以減小，不允許提高。

 

3、氣相色譜

（1）柱參數(shù)

固定相粒徑：粒徑最多可減少50%，不允許增加（填充柱）。

膜厚：可以在-50%~+100%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)（毛細(xì)管柱）。

色譜柱長度：色譜柱長度可以±70%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

色譜柱內(nèi)徑：可以在±50%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

（2）流速（GC）：可以在±50%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

（3）柱溫（GC）：可以在±10%范圍內(nèi)調(diào)節(jié)。

 

（4）進(jìn)樣體積和分流比：若待檢峰的靈敏度和重復(fù)性可以滿足的話，可以調(diào)節(jié)。