近期，華東理工大學(xué)劉昌勝院士/屈雪教授于 Bioactive Materials 上聯(lián)合發(fā)表研究性論文：利用中藥調(diào)節(jié)生物活性組織粘合劑的凝膠動(dòng)力學(xué)，用于快速止血或微創(chuàng)體內(nèi)組織封閉。研究通過向聚乙二醇-溶菌酶（PEG-LZM）酰胺化水凝膠中引入硼砂調(diào)控-NH2的去質(zhì)子化，實(shí)現(xiàn)了凝膠速率從幾秒到幾分鐘的可控調(diào)節(jié)，并成功證實(shí)該體系可有效應(yīng)用于緊急傷口閉合或微創(chuàng)組織密封。本研究為pH敏感型水凝膠的成膠動(dòng)力學(xué)調(diào)控提供了一種簡便策略。
研究內(nèi)容簡介
雙組分原位交聯(lián)的可注射水凝膠具有遞送方便、形狀適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)。其中，酰胺化反應(yīng)觸發(fā)的水凝膠對生物組織界面的強(qiáng)共價(jià)結(jié)合能力，使其作為組織粘合劑被廣泛研究。不同類型傷口對凝膠速率的精準(zhǔn)調(diào)控提出了較高要求。然而，調(diào)整凝膠前驅(qū)液濃度或交聯(lián)劑含量的常規(guī)調(diào)控方式將不可避免地改變水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度、內(nèi)部結(jié)構(gòu)、降解速度等性質(zhì)。因此，亟需制定一種可精準(zhǔn)調(diào)控凝膠速率，而不影響水凝膠其他性能的有效策略。
該研究開發(fā)了一種基于末端修飾活性酯的四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS)和溶菌酶（LZM）雙組分的可注射水凝膠粘合劑，其中，4-arm-PEG-NHS上的活性酯可與LZM以及組織表面的-NH2發(fā)生酰胺化反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)水凝膠的原位交聯(lián)。受啟發(fā)于N原子去質(zhì)子化可加速酰胺化反應(yīng)的理論，研究人員推測具備pH緩沖能力的化合物可通過調(diào)控水凝膠體系酸堿度，增強(qiáng)–NH2親核性，并以劑量依賴的方式調(diào)控凝膠速率。中藥硼砂（Na2B4O7·10H2O）是一種典型的強(qiáng)堿弱酸鹽，其B4O72-可被水解成等量的B(OH)3和B(OH)-4，兩者形成的酸堿平衡（pKa≈9.2）可將溶液pH維持在弱堿性?；诖?，該研究將硼砂引入PEG-LZM酰胺化水凝膠，成功賦予其凝膠動(dòng)力學(xué)的可調(diào)性（圖1）。一方面，硼砂會(huì)消耗質(zhì)子氫，促進(jìn)–NH2去質(zhì)子化，加速酰胺化反應(yīng)；另一方面，硼砂可以延緩酰胺化反應(yīng)副產(chǎn)物（N-羥基琥珀酰亞胺）造成的pH降低，使水凝膠具備與生物組織類似的酸堿度。此外，硼砂還具有防腐、抗菌、抗病毒等優(yōu)點(diǎn)，可賦予水凝膠豐富的生物活性。
圖1：硼砂促進(jìn)-NH2去質(zhì)子化，調(diào)控PEG-LZM水凝膠的凝膠速率。
電解水實(shí)驗(yàn)證明酸性環(huán)境不利于成膠反應(yīng)，而OH-形成的堿性環(huán)境有助于快速凝膠化。對比NaOH和硼砂在水凝膠體系(pH=8.9)中的添加效果，NaOH非緩沖體系的成膠時(shí)間在300 s以上，而硼砂緩沖體系的成膠時(shí)間則縮減至3 s內(nèi)，這證實(shí)了凝膠速率的顯著提高歸因于硼砂強(qiáng)大的pH緩沖能力；采用H2BO3和HCl將水凝膠體系pH降到8.6后，兩組的成膠時(shí)間延長至相同水平，這進(jìn)一步證明硼砂提高凝膠速率歸因于其pH緩沖能力，而非元素組成。通過改變LZM前驅(qū)液中硼砂含量，可以實(shí)現(xiàn)成膠時(shí)間從幾秒到幾分鐘的可控調(diào)節(jié)，表明硼砂對凝膠速率的調(diào)控呈劑量依賴型（圖2）。
圖 2：硼砂調(diào)控凝膠速率的機(jī)理研究。
體內(nèi)外微生物實(shí)驗(yàn)證明PEG-LZM/硼砂水凝膠具有顯著抗菌活性，且抗菌能力隨硼砂含量增加而提高。
圖3：PEG-LZM /硼砂水凝膠的抗菌活性。
生物相容性實(shí)驗(yàn)證明最高硼砂含量（10 mg mL-1）的PEG-LZM水凝膠可保持良好的細(xì)胞相容性；大鼠背部皮下植入實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明材料植入一周后僅水凝膠-組織界面出現(xiàn)少量炎癥細(xì)胞（綠色箭頭），即正常短期異物反應(yīng)；溶血實(shí)驗(yàn)證明水凝膠具有優(yōu)異的血液相容性。
圖4：PEG-LZM /硼砂水凝膠的生物相容性。
在兔左心室（LV）壁穿透性缺陷模型（d：1.2 mm）中，4-arm-PEG-NHS、LZM和硼砂的前驅(qū)液被注射到傷口后，在血液存在時(shí)迅速成膠，幾秒內(nèi)成功閉合缺損。超聲心動(dòng)圖（ECHO）顯示手術(shù)3周后，左心室射血分?jǐn)?shù)（EF%）和縮短分?jǐn)?shù)（FS%）恢復(fù)至正常水平。以上結(jié)果證明，硼砂調(diào)節(jié)的高凝膠速率PEG-LZM水凝膠可應(yīng)用于緊急傷口密封。
圖5：兔左心室壁穿透性缺陷模型的緊急傷口密封。
大鼠胃穿孔模型（d：2mm）微創(chuàng)手術(shù)證明凝膠速率可調(diào)為水凝膠的微創(chuàng)輸送提供了便利，通過導(dǎo)管注射PEG-LZM/硼砂水凝膠前驅(qū)液使其原位成膠，可成功密封微創(chuàng)缺陷，且手術(shù)2周后仍保持密封完整。H&E染色結(jié)果顯示PEG-LZM/硼砂水凝膠治療組的胃黏膜和肌肉層已完全修復(fù)，治療效果顯著優(yōu)于其它組別，這可歸因于硼砂豐富的藥理活性和溶菌酶的高細(xì)胞親和力。以上結(jié)果證明，PEG-LZM/硼砂水凝膠可作為微創(chuàng)組織密封的高性能密封劑。
圖6：大鼠胃穿孔模型的微創(chuàng)組織密封。
綜上所述，該工作基于末端修飾活性酯的四臂聚乙二醇(4-arm-PEG-NHS) 與LZM以及組織表面-NH2的酰胺化反應(yīng)，引入硼砂加速-NH2的去質(zhì)子化，實(shí)現(xiàn)了體系凝膠速率從幾秒到幾分鐘的可控調(diào)節(jié)，開發(fā)了一種凝膠動(dòng)力學(xué)可控且具有多功能生物活性的PEG-LZM/硼砂水凝膠粘合劑，并成功證實(shí)該體系可有效應(yīng)用于緊急傷口閉合和微創(chuàng)組織密封。更重要的是，該工作為其他pH敏感型水凝膠的凝膠動(dòng)力學(xué)精準(zhǔn)調(diào)控提供了一種簡便、高效的策略。
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