摘 要｜Abstract
國際標準化組織（ISO）于2022 年4 月19 日發(fā)布全球首個專門針對新型冠狀病毒核酸檢測的國際標準——ISO/TS 5798:2022《體外診斷檢驗系統(tǒng)——核酸擴增法檢測新型冠狀病毒（SARSCoV-2）的要求及建議》。本文對該標準通用要求部分進行分析及研究，并與我國2021 年11 月26 日發(fā)布的GB/T 40982—2021《新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價要求》進行比對，以期為我國體外診斷試劑開發(fā)商、制造商，以及SARS-CoV-2 研究和診斷機構(gòu)提供參考。
The first international standard specifically for nucleic acid testing of COVID-19—In vitro diagnostic test systems-Requirements and recommendations for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) by nucleic acid amplification methods (ISO/TS 5798:2022) was published by International Organization for Standardization (ISO) on April 19,2022. This paper analyzes and researches on the general requirements of ISO/TS 5798:2022, and compares it with the Quality assessment requirements for severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 nucleic acid detection kit (GB/T 40982—2021) released on November 26, 2021. This paper aims to provide reference for the in vitro diagnostic developers and manufacturers, as well as institutions and organizations supporting SARS-CoV-2 research and diagnostics in China.
新型冠狀病毒（SARSCoV-2）是目前已知的第七種感染人類的冠狀病毒[1]。冠狀病毒是一種廣泛分布于動物界的有包膜RNA 病毒，已在人類和其他哺乳動物以及鳥類中發(fā)現(xiàn)。冠狀病毒之所以被如此命名，是因為在電子顯微鏡下觀察時，可見病毒表面刺突蛋白所構(gòu)成的形似光暈的棒狀突起， 這些刺突蛋白能夠促進病毒附著和進入細胞。冠狀病毒大致呈球形，直徑為118~136nm， 其基因組大小在26~32kb 之間， 是目前已知RNA 病毒中最大的病毒。由SARS-CoV-2 引起的疾病被世界衛(wèi)生組織（WHO）命名為COVID-19[2]。
SARS-CoV-2 可通過飛沫和氣溶膠傳播，也有可能通過與無癥狀或有癥狀感染者接觸等方式傳播，并在上呼吸道和下呼吸道中復(fù)制。與嚴重急性呼吸綜合征（SARS）和中東呼吸綜合征（MERS）類似，已報告發(fā)生超級傳播事件。大多數(shù)感染并不復(fù)雜，5%~10% 患者住院治療主要是由于肺炎和其他嚴重炎癥，呼吸系統(tǒng)和多器官衰竭等并發(fā)癥的發(fā)生風險會隨著年齡的增長，以及患有高血壓、糖尿病、慢性心血管疾病、慢性肺部疾病以及免疫缺陷病而增加。
不可否認，現(xiàn)階段COVID-19 仍然是國際關(guān)注的公共衛(wèi)生事件，特別是可能出現(xiàn)SARS-CoV-2 新變異株和國際傳播，繼續(xù)對全世界人民帶來健康威脅。目前雖然有些國家和地區(qū)已經(jīng)取消對新冠防控的各種限制，但正如WHO 總干事譚德塞在2022 年9 月22 日媒體通報會上的講話，大流行尚未結(jié)束，終點已經(jīng)在望，但能夠看到終點并不意味著已經(jīng)到達終點，病毒仍在傳播，仍在變化，出現(xiàn)更危險變異株的風險始終存在[3]。
疫情發(fā)生至今，各國均認識到，與研發(fā)疫苗和藥物同等重要的，是需要具備快速識別、檢測、隔離和治療COVID-19 患者并對接觸人群進行檢疫以控制傳播的能力。COVID-19 的臨床管理及SARS-CoV-2 感染和傳播的防控需要準確高效的體外診斷。現(xiàn)階段已有不少檢測SARSCoV-2 的方法和試劑盒，且更精準高效的檢測手段還在持續(xù)增加。當前SARS-CoV-2 最主要的2種檢測路徑，分別是基于分子學的熒光PCR 方法的核酸檢測和基于免疫學的SARS-CoV-2 抗原檢測?？乖瓩z測速度快、成本低，但有一定漏檢率，結(jié)果需要確認測試；而核酸檢測準確性高、特異性強，是目前SARS-CoV-2檢測的金標準。
由此可見， 持續(xù)設(shè)計、開發(fā)和建立更加精準高效的SARS-CoV-2 核酸檢測方法是COVID-19 防控的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是為今后突發(fā)公共衛(wèi)生安全事件應(yīng)對儲備標準與方法成果。在檢測方法及試劑盒的開發(fā)和日常應(yīng)用過程中，應(yīng)建立其綜合質(zhì)量評價指標，確保檢測結(jié)果的準確性。為此， 國際標準化組織（ISO）于2022 年4 月19 日正式發(fā)布全球首個專門針對SARS-CoV-2檢測的國際標準——ISO/TS5798:2022《體外診斷檢驗系統(tǒng)—— 核酸擴增法檢測新型冠狀病毒（SARS-CoV-2） 的要求及建議》[In vitro diagnostic test systems-Requirements and recommendations for detection of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2)by nucleic acid amplification methods][4]。本文主要對該標準通用要求部分進行分析及研究，同時與國家市場監(jiān)督管理總局和國家標準化管理委員會于2021年11 月26 日聯(lián)合發(fā)布的GB/T40982—2021《新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價要求》[5]國家標準進行比對，以期為我國體外診斷試劑開發(fā)商、制造商，以及SARS-CoV-2 研究和診斷機構(gòu)及組織提供參考。
1、 ISO/TS 5798:2022通用要求概述
ISO/TS 5798:2022 為采用核酸擴增技術(shù)檢測SARSCoV-2 分析測試的程序步驟、設(shè)計開發(fā)、驗證確認、生產(chǎn)轉(zhuǎn)化和實施使用等提出要求和建議。該標準中詳細規(guī)定了采用核酸擴增試驗（NAAT） 進行SARSCoV-2 分子檢測的流程。
1.1 檢測前程序
檢測前程序包括臨床樣本采集、運輸、儲存、樣本溶解、核酸提取和濃縮。一般應(yīng)考慮：使用適當?shù)膫€人防護設(shè)備（PPE）；參考SARS-CoV-2 相關(guān)暴露或感染特點確定樣本類型選擇；根據(jù)所選樣本類型，按照規(guī)范要求采集樣本；樣本在包裝、運輸和儲存時，應(yīng)采取適當?shù)纳锇踩胧⒖紤]對病毒核酸降解的影響；在實驗室檢測前，所有樣本的初始處理（滅活前）應(yīng)在經(jīng)過驗證的生物安全柜或封閉裝置中進行。
1.2 檢測程序
檢測程序包括逆轉(zhuǎn)錄（cDNA合成）和適當?shù)臄U增方法。為避免交叉污染，所有檢測活動均應(yīng)使用單獨的設(shè)備和（或）一次性用品，實驗人員做好個人防護；樣本提取、反應(yīng)試劑制備和擴增處理應(yīng)在單獨的實驗室進行，即使全自動化的分析檢測也需要專用區(qū)域，避免在不同工作區(qū)移動儀器或共用設(shè)備；除非用于擴增后步驟，否則應(yīng)盡量避免打開管蓋；在進行檢測時，應(yīng)嚴格遵守核酸擴增法檢測實驗室的分區(qū)要求；可以將脫氧尿苷三磷酸（dUTP）和尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）加入反應(yīng)混合液中，以消除擴增子污染；樣本檢測過程中應(yīng)考慮廢物的臨時儲存和處置問題，如果保存有價值的生物樣本材料，可考慮建立生物庫。另外，實驗室應(yīng)建立信息系統(tǒng)，用于采集、處理、記錄、報告、存儲或檢索有關(guān)檢測和檢測前數(shù)據(jù)及相關(guān)信息。
1.2.1 計量學溯源
標準品應(yīng)可溯源至已驗證的SARS-CoV-2 標準物質(zhì)， 如WHO 關(guān)于SARS-CoV-2 標準品[6] 或適當?shù)牡韧镔|(zhì)，也可根據(jù)外部質(zhì)量保證計劃對試驗進行驗證。不同來源的標準物質(zhì)檢測結(jié)果應(yīng)一致。標準物質(zhì)應(yīng)在規(guī)定的溫度和條件下儲存和處理，并在失效日期前使用，否則會影響檢測結(jié)果。實驗室可按照要求制備內(nèi)部參考品，用于制備標準物質(zhì)的材料應(yīng)包括與檢測樣本相同類型或具有相同成分的物質(zhì)，以及滅活的SARS-CoV-2 或假病毒；滅活病毒或制備的假病毒應(yīng)在通過參考測量程序確定濃度后使用，例如采用經(jīng)驗證的定量方法，如數(shù)字PCR（dPCR）測定濃度以確保結(jié)果的準確性。應(yīng)明確規(guī)定內(nèi)部制備的標準物質(zhì)的儲存條件和時間，并對其進行驗證，以避免目標核酸的損失。
1.2.2 陽性閾值
對于PCR 核酸擴增方法，陽性閾值是指Cq 臨界值，可確定目標核酸是否存在，并定義哪些檢測結(jié)果報告為“已檢出”，哪些檢測結(jié)果報告為“未檢出”。設(shè)置合適的陽性閾值關(guān)系到檢測的臨床特異性和臨床靈敏度。對擴增信號放大的確認可用于結(jié)果解釋。Cq 值應(yīng)與擴增曲線的形狀相比較。在沒有 SARS-CoV-2RNA 的情況下，經(jīng)過設(shè)計和優(yōu)化的SARS-CoV-2 PCR 將不會產(chǎn)生Cq 信號。任何區(qū)分陰性和陽性結(jié)果的Cq 臨界值都應(yīng)通過臨床樣本進行驗證。高Cq 值用于排除由于病毒量低或非特異性擴增引起的極低信號。應(yīng)注意，除非結(jié)果具有一致性，否則不同實驗室的Cq 值不應(yīng)直接比較，應(yīng)使用有證標準物質(zhì)進行比較。
1.2.3 包裝和使用說明
所使用的試劑盒包裝應(yīng)完好無損，標簽清晰并注明產(chǎn)品名稱、批號、內(nèi)容物、有效期、貯存條件等情況。使用說明應(yīng)詳細列出應(yīng)用的預(yù)期用途和處理程序，包括目標用戶、應(yīng)用領(lǐng)域、檢測結(jié)果解釋、處理程序和注意事項。
1.3 檢測后程序
檢測后程序包括廢物管理和檢測結(jié)果報告等。由于SARSCoV-2 具有致病性，因此任何情況下都應(yīng)遵循生物風險管理程序，并在完成實驗室檢測后恰當執(zhí)行以下程序：剩余臨床樣本的保存和處理；擴增后廢棄樣品的處理；實驗室和設(shè)備的清潔和凈化；擴增后產(chǎn)物的儲存和處置。
實驗室檢測后應(yīng)提供相應(yīng)的檢測報告，檢測報告的內(nèi)容應(yīng)至少包含以下信息：必要的樣本信息、檢測樣本種類、檢測方法、樣本采集時間、貯存和運送時間及條件、報告發(fā)布時間、檢測結(jié)果的判斷和解釋信息、結(jié)果審核和授權(quán)發(fā)布人員信息。
1.4 質(zhì)量評價體系
ISO/TS 5798:2022 明確了準確性、檢出限、包容性、特異性、穩(wěn)健性等病毒檢測的性能驗證評價指標，全面構(gòu)建了SARSCoV-2 核酸檢測質(zhì)量評價體系。核酸擴增檢測中的質(zhì)量屬性包括但不限于：適當提取程序性能評估、評估檢測試劑是否滿足最低檢測標準、分析特異性的綜合評估、試驗的檢出限以及試劑穩(wěn)定性評價。質(zhì)量屬性評價技術(shù)流程如圖1 所示，包括對整個過程和關(guān)鍵分析性能的評價。對于只使用一種核酸提取方法的核酸擴增試驗，或者提取方法是工作流程的一個必要組成部分時，核酸提取部分的質(zhì)量評價并非是必需的。
1.5 擴增技術(shù)的選擇
ISO/TS 5798:2022 指出應(yīng)根據(jù)檢測要求和環(huán)境，結(jié)合每種擴增技術(shù)的特點選擇適合的核酸擴增技術(shù)。在適用條件下，逆轉(zhuǎn)錄后，每種擴增技術(shù)特點如下。
1.5.1 實時定量PCR（qPCR）
適用于樣本定性或定量檢測。建議使用熒光定量PCR 儀器，并提供穩(wěn)定的電流供應(yīng)。qPCR具有高分析靈敏度和高通量，操作簡單，但反應(yīng)時間相對較長。
1.5.2 dPCR
適用于樣本絕對定量檢測，由于樣本需求量低，故其也適用于珍貴或降解嚴重的核酸樣本。通常建議專門提供一臺分析和讀取樣本的dPCR 儀，具有反應(yīng)芯片或液滴發(fā)生器并提供穩(wěn)定電流。盡管檢出限低，但其檢測通量取決于儀器系統(tǒng)，另外操作更加復(fù)雜，反應(yīng)時間也相對較長。
1.5.3 等溫擴增法
適用于樣本定性評價，熱循環(huán)器和穩(wěn)定電流供應(yīng)并不是必需的，該方法的特點是低檢出限、低通量、反應(yīng)時間短，易于操作。
2、 與國家標準比對
在ISO/TS 5798:2022 發(fā)布前，國家市場監(jiān)督管理總局和國家標準化管理委員會在2021 年11 月26 日就聯(lián)合發(fā)布了GB/T40982—2021《新型冠狀病毒核酸檢測試劑盒質(zhì)量評價要求》，并于2022 年3 月1 日起實施。兩個標準的比較結(jié)果詳見表1。
ISO/TS 5798:2022 是由我國牽頭，聯(lián)合多國專家共同制定的，我國專家團隊全程深度參與，發(fā)揮了關(guān)鍵作用，因此ISO/TS5798:2022 與 GB/T 40982—2021 本質(zhì)和原則是一致的，都為病毒檢測提供了質(zhì)量評價要求和標準化手段。區(qū)別在于，ISO/TS 5798:2022 是在全球各國SARS-CoV-2 檢測試劑和實驗分析流程缺乏統(tǒng)一的技術(shù)規(guī)范和質(zhì)量要求的大背景下提出，旨在國際范圍內(nèi)建立統(tǒng)一的SARSCoV-2 核酸檢測標準，規(guī)范各國檢測方法和流程，以保障檢測質(zhì)量，從而有效控制疫情蔓延，考慮到許多發(fā)展中國家體外診斷試劑還處于起步發(fā)展階段， 因此ISO/TS 5798:2022 內(nèi)容更加全面，規(guī)定更加細致，從術(shù)語定義到具體的檢測程序、設(shè)計開發(fā)、驗證確認、生產(chǎn)轉(zhuǎn)化和實施使用都做了詳盡說明。而GB/T40982—2021 主要從質(zhì)量評價和實驗方法方面提出要求，規(guī)范清晰明了，同時在附錄部分詳細注明SARS-CoV-2 核酸檢測試劑國家參考品的具體用途、規(guī)格和組成、特性量值和注意事項，為國內(nèi)體外診斷試劑開發(fā)人員和制造商及研究機構(gòu)、醫(yī)學實驗室提供產(chǎn)品質(zhì)量要求的基本遵循和可參考的技術(shù)依據(jù)，實操性更強。
3、 結(jié)語
疫情發(fā)生以來，我國一直著力提升核酸檢測這項核心能力，3年來，我國核酸檢測技術(shù)取得飛速進步，核酸檢測能力全球領(lǐng)先。截至2022 年12 月， 國家藥監(jiān)局已批準128 個SARS-CoV-2檢測試劑盒（45 個核酸檢測試劑、41 個抗體檢測試劑、42 個抗原檢測試劑） 上市[7]。隨著我國SARS-CoV-2 檢測技術(shù)不斷取得突破，產(chǎn)品質(zhì)量不斷提升，已成為全球最大的SARS-CoV-2檢測試劑盒生產(chǎn)國，面向全球銷售，國內(nèi)多家體外診斷產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)的SARS-CoV-2 核酸檢測試劑被列入WHO 應(yīng)急使用清單，以可靠優(yōu)質(zhì)的產(chǎn)品助力全球抗疫。此次ISO/TS 5798:2022 由我國牽頭制定，從立項到發(fā)布僅用16個月，是國際標準化組織醫(yī)用臨床檢驗實驗室和體外診斷系統(tǒng)標準化技術(shù)委員會（ISO/TC212）成立以來用時最短的非快速程序制定發(fā)布的標準，并最終以96%的贊成率高票通過，充分體現(xiàn)了我國體外診斷領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新水平。此外，參與國際標準制定還提升了我國在該領(lǐng)域的話語權(quán)和影響力，更加有利于國內(nèi)體外診斷行業(yè)和企業(yè)的發(fā)展。
鑒于COVID-19 大流行的現(xiàn)狀和不可預(yù)測的動態(tài)，仍需抑制SARS-CoV-2 傳播。在檢測方法和試劑盒的開發(fā)及日常應(yīng)用過程中，應(yīng)嚴格遵循國際標準和國家標準各項質(zhì)量評價指標，確保檢測結(jié)果的準確性。遵循國際標準，與全球SARS-CoV-2 核酸檢測質(zhì)量評價標準相一致，可促成SARS-CoV-2 核酸檢測技術(shù)的兼容性和互通性，有助于我國核酸檢測試劑的出口。
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