藥品雜質(zhì)對(duì)照品是藥物質(zhì)量研究的關(guān)鍵因素，然而有些雜質(zhì)對(duì)照品價(jià)格昂貴，例如25mg瓶裝的化合物往往需要數(shù)萬元，這極其加大了企業(yè)的研發(fā)成本。雜質(zhì)對(duì)照品價(jià)格之所以昂貴的原因一方面在于合成和提純難度大、物料和人工成本等，另一方面在于某雜質(zhì)為自身工藝所產(chǎn)生，含量低且結(jié)構(gòu)未知，市場(chǎng)上購買不到。本文主要討論未知結(jié)構(gòu)且含量微小的雜質(zhì)對(duì)照品的制備獲取方法-富集法，文末有實(shí)例分享，歡迎大家探討。
藥物雜質(zhì)主要來源于兩方面：合成過程和貯藏過程中生成的雜質(zhì)。對(duì)于質(zhì)量研究中出現(xiàn)的某個(gè)雜質(zhì)，通過合成過程的雜質(zhì)譜分析，仍無法推導(dǎo)其可能的結(jié)構(gòu)式，且含量微小時(shí)，此時(shí)只能通過“富集法”。“富集法”需要耗費(fèi)一定的物料、試劑、人工和時(shí)間成本，如何提高富集法的效率，值得思考。
1、 富集法的目的和方法
富集法的目的在于運(yùn)用各種分離方法，從混合物中富集未知結(jié)構(gòu)且含量微小的化合物。因此，富集法第一步在于目標(biāo)混合物的獲取。一般情況下，根據(jù)該雜質(zhì)的來源：合成過程或貯藏過程。對(duì)于合成過程中產(chǎn)生的雜質(zhì)，通常參照工藝路線，改變反應(yīng)物料比和反應(yīng)溫度、時(shí)間等，收集獲得的中間體或者濾液進(jìn)行分離；而對(duì)于貯藏過程產(chǎn)生的雜質(zhì)，則參考穩(wěn)定性影響因素試驗(yàn)，采用高溫、高濕、酸堿、氧化等破壞條件驗(yàn)，從而得到目標(biāo)混合物。
富集法第二步在于綜合運(yùn)用各種分離方法（結(jié)晶、萃取、制備色譜等），富集得到目標(biāo)化合物。由于本文主要討論含量微小雜質(zhì)的富集，從提升工作效率方面考慮，下文主要討論制備色譜法在富集法的開發(fā)應(yīng)用，包括：反相制備色譜和正相制備色譜。
2、 富集法的方法開發(fā)過程
2.1分析目標(biāo)混合物的有關(guān)性質(zhì)
利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，分析混合物中目標(biāo)化合物的分子量和分離情況，了解該化合物的親酯親水性，考察目標(biāo)雜質(zhì)峰和附近的色譜峰在不同的流動(dòng)相（酸堿性或緩沖鹽）中的分離度差異。配制目標(biāo)雜質(zhì)的混合物溶液，考察在冰浴或室溫過夜放置的穩(wěn)定性，為后期收集的制備溶液的去除提供參考依據(jù)。
2. 2 對(duì)于目標(biāo)混合物的預(yù)處理
目標(biāo)混合物預(yù)處理的目的是為了去除影響分離純化的其他雜質(zhì)峰，從而提高分離效率。例如參照工藝合成過程得到的是反應(yīng)液時(shí)，由于主成分比例高，制備色譜分離時(shí)，容易濃度超載，進(jìn)而形成寬峰和拖尾，降低分離度。因而優(yōu)選通過析晶法去除主產(chǎn)物或者收集濃縮母液。而對(duì)于強(qiáng)制降解試驗(yàn)中的酸堿或氧化法，則通常需要調(diào)節(jié)Ph至中性或淬滅氧化劑。另外，可以加入有機(jī)相萃取反應(yīng)液，考察目標(biāo)雜質(zhì)在有機(jī)相和水相的溶解度差異，初步提純。
2.3制備色譜方法的選擇
制備色譜方法包括反相制備色譜和正相制備色譜，反相制備色譜流動(dòng)相中的水相常加入酸或緩沖鹽（例如：甲酸、乙酸銨），有機(jī)相則常使用甲醇或乙腈，適用于非極性或弱極性化合物的分離。正相制備色譜流動(dòng)相都是有機(jī)相，可自由選擇正己烷、二氯甲烷、乙酸乙酯、乙腈、乙醇等兩相或多相混合，適用于極性化合物和異構(gòu)體的分離。親水混合物優(yōu)選反相制備色譜，而親酯混合物兩者皆可使用，有著不同的選擇性。需要注意的是，正相制備色譜，不同有機(jī)相混合洗脫時(shí)，出峰順序可能會(huì)有所不同。
2.4制備色譜方法的開發(fā)
2.4.1 初步快速分離富集
由于雜質(zhì)含量微小且通常成分復(fù)雜，一次分離往往難以得到純度合格的雜質(zhì)對(duì)照品。因而分離純化的第一步是快速的初步富集，即通過建立反相或正相制備方法，優(yōu)選等度洗脫，以“濃度超載”或“體積超載”連續(xù)進(jìn)樣，收集目標(biāo)雜質(zhì)對(duì)應(yīng)的色譜峰段。需要注意的是，對(duì)于成分復(fù)雜者，此種連續(xù)進(jìn)樣法，色譜峰型可能相當(dāng)難看，我們需要分段收集送檢，定位到目標(biāo)雜質(zhì)所在位置即可。
對(duì)于初步富集得到的制備液體，往往體積比較多，需要濃縮除去有關(guān)溶劑。從“2.1分析目標(biāo)混合物的有關(guān)性質(zhì)”中，我們可以得到目標(biāo)雜質(zhì)的穩(wěn)定性和親水親酯性。對(duì)于制備溶液，如果是采用正相制備色譜的話，低溫減壓旋除有機(jī)溶劑即可。如果是反相制備色譜的話，由于含有水相，分以下兩種情況操作。親酯性的話則低溫減壓旋除有機(jī)相，加入其它不溶于水的有機(jī)相（乙酸乙酯或二氯甲烷）萃取，低溫減壓旋除有機(jī)溶劑。親水性且雜質(zhì)穩(wěn)定的話，則減壓旋除大部分水相；親水性且雜質(zhì)不穩(wěn)定的話，可以通過冷凍干燥法濃縮。
2.4.2進(jìn)一步細(xì)分純化
得到初步的分離富集濃縮液體后，目標(biāo)雜質(zhì)的含量比往往提高不少。此時(shí)需要進(jìn)行細(xì)分純化。由于經(jīng)過初步分離后，主成分已經(jīng)去除或者大部分去除。制備液相方法的開發(fā)可以在初步富集方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，加大進(jìn)樣而不受主成分的寬峰和拖尾影響。此過程主要考慮的是目標(biāo)雜質(zhì)的分離度，以得到純度合格的目標(biāo)雜質(zhì)。通過調(diào)節(jié)洗脫梯度，水相調(diào)節(jié)劑的添加（酸堿、緩沖鹽），有機(jī)相的選擇（單一或復(fù)配）正相溶劑的選擇（兩相或者多相）。值得一提的是，由于正相制備色譜的特殊選擇性，對(duì)于難以分離的同分異構(gòu)體或者極性相近者，往往有意想不到的分離度。
2.4.3 純化分離后處理
純化分離結(jié)束后，去除溶液即可得到目標(biāo)雜質(zhì)。對(duì)于不同的親水親酯性，不同的雜質(zhì)穩(wěn)定性，具體操作請(qǐng)參考“2.4.1”制備液體的濃縮去除。需要注意的是，對(duì)于反相制備色譜水相加入緩沖鹽分離的，需要采用不含鹽的水相-有機(jī)相再次制備除去緩沖鹽。最后就是基于大部分雜質(zhì)的熱不穩(wěn)定性，整個(gè)純化分離過程，盡可能冰浴低溫保存，或者更低溫度保存。
實(shí)例分享：某抗生素雜質(zhì)的制備富集過程
目標(biāo)雜質(zhì)混合物的獲取方法
影響因素試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該雜質(zhì)在高溫高濕下有生成的趨勢(shì)，然而通過改變溫度和濕度，該雜質(zhì)含量最多約0.5%左右，且結(jié)構(gòu)無法推導(dǎo)出來。
分析目標(biāo)混合物的有關(guān)性質(zhì)
通過液質(zhì)聯(lián)用，得知該化合物分子量M，主成分約95%，目標(biāo)雜質(zhì)峰附近有多個(gè)雜質(zhì)峰，成分較復(fù)雜。目標(biāo)雜質(zhì)偏親水性，反相洗脫出峰快。該雜質(zhì)穩(wěn)定，耐熱。
對(duì)于目標(biāo)混合物的預(yù)處理
往破壞降解物加入水和乙酸乙酯混合溶液，萃取分液，收集水相。
初步快速分離富集
由于目標(biāo)雜質(zhì)親水性，首選反相制備色譜。參照反相分析方法，調(diào)節(jié)水相和有機(jī)相，建立等度洗脫方法，快速分離富集。
進(jìn)一步細(xì)分純化
優(yōu)化反相制備色譜法，梯度洗脫，得到純度合格的目標(biāo)雜質(zhì)制備液。
純化分離后處理
減壓濃縮除去水相和有機(jī)相后，得到目標(biāo)雜質(zhì)，低溫保存，富集完成。
總結(jié)：有些藥物雜質(zhì)價(jià)格昂貴，需要委外定制合成，加大企業(yè)研發(fā)成本。此種情況下，富集法或許是一種比較好的選擇。如何更好的提升這種微量雜質(zhì)的富集效率，值得大家探討。例如優(yōu)化的色譜方法的建立等等。
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