前言
項目研發(fā)過程中，原輔料采用光散射法進行粒度分析時，為粒度分析方法的開發(fā)與驗證提供技術(shù)支持。本文針對原輔料的光散射法粒度分析方法開發(fā)與驗證全過程進行探討，粒度分析方法開發(fā)和驗證，均應(yīng)基于代表性的樣品進行。
一、分析方法開發(fā)
采用激光散射法進行粒度分析時，根據(jù)樣品的性狀和溶解性能，選擇濕法或干法測定；濕法測定用于測定混懸供試品或不溶于分散介質(zhì)的供試品，干法測定常用于測定水溶性或無合適分散介質(zhì)的固態(tài)供試品。
1、濕法測定開發(fā)
濕法測試結(jié)果穩(wěn)定，一次取樣循環(huán)測量，特別適合非常細小的顆粒（幾微米以下）；測量條件溫和，尤其適合易碎的顆粒樣品。
濕法測定開發(fā)過程中，需要考察的項目主要有樣品的制備（分散介質(zhì)、超聲時間）、遮光度、攪拌速度等。
（1）樣品制備
濕法測定時，樣品分散很關(guān)鍵，需要有合適的分散劑，大多數(shù)情況下還需要選擇表面活性劑或助分散劑、超聲幫助樣品分散均勻。
① 分散介質(zhì)：濕法測定需要選擇合適的分散介質(zhì)。
a、不與樣品發(fā)生反應(yīng)（不溶解，也不會促進樣品團聚）
b、很好地浸潤樣品
c、能夠溶解所添加的添加劑/助分散劑
d、首選分散介質(zhì)為水
e、當樣品不易溶于水時，可考慮其他溶劑
f、如果樣品微溶于水，可考慮配制飽和溶液進行測量
示例：水、飽和水溶液、Isopar G、葵花籽油等
② 表面活性劑或助分散劑
當樣品在分散介質(zhì)中，不能均勻分散時，呈漂浮、團聚等狀態(tài)時，需要選擇合適濃度的表面活性劑或助分散劑。常用的有：Tween、SDS、卵磷脂等。
示例：5%雞蛋卵磷脂-Isopar G溶液、2%吐溫-80溶液或2%吐溫-20溶液
③ 超聲
超聲是非常有效的分散手段，合理控制超聲強度與時間，可以有助于樣品分散。增加超聲強度比延長超聲時間更有效?？梢酝ㄟ^超聲滴定，比較無超聲，或不同超聲時間，結(jié)合樣品的粒度變化及RSD的范圍，選擇合適的超聲方式。超聲過程中，要注意所用超聲儀器的超聲強度，即超聲波頻率、超聲波功率。不同的超聲強度，對樣品團聚顆粒的分散程度不同，可能會影響數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。應(yīng)在方法中注明樣品超聲處理的儀器或者超聲強度，提高方法在不同實驗室操作時的重現(xiàn)性。
示例：采用超聲處理樣品，結(jié)果如下圖，隨著超聲時間的延長，最終粒徑的變化趨于平緩且RSD滿足標準，表明測得結(jié)果可接受。
超聲時間
（2）遮光度
加入足夠的有代表性的樣品，直到有穩(wěn)定的遮光度和數(shù)據(jù)信號。樣品量太少，則信噪比會比較差，或者樣品的代表性不夠，特別是對于寬分布的樣品。樣品量太多，則會發(fā)生多重衍射，影響最后的測量結(jié)果，特別是粒徑比較小的時候（典型的＜10μm）?？梢酝ㄟ^遮光度滴定，結(jié)合樣品的粒度變化及RSD的范圍，選擇合適的遮光度。對于大部分樣品，遮光度建議考察值為：
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樣品的Dx50
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遮光度建議范圍
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＜10μm
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5%~10%
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10μm＜Dx50＜100μm
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10%~15%
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＞100μm
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15%~20%
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（3）攪拌速度
攪拌，采用機械剪切力分散樣品，避免顆粒沉淀，保持良好的懸??；過高的轉(zhuǎn)速可能會破碎顆粒，或產(chǎn)生氣泡。對于樣品池中攪拌速度的考察，特別是對于比重大的顆粒，應(yīng)進行泵速滴定（一般為1500~2500rpm）。需要結(jié)合粒度的變化及RSD的范圍，篩選一個合適的攪拌速度將大顆粒懸浮起來，保證整個樣品池流動的樣品均勻。
示例：對某樣品進行泵速滴定，＞2500rpm處于平臺期，因此可選擇2500rpm作為該品種的攪拌速度。
2、干法測定開發(fā)
干法測定，所有物料必須懸浮在氣流中，只有通過光束的物料才能被測量。測量時，只有物理力作用，如顆粒之間的碰撞，顆粒與樣品池、輸送管道碰撞，高壓空氣等。干法分散是樣品分散和破碎之間的競爭。
干法測定開發(fā)過程中，需要考察的項目主要有遮光度、分散氣壓、進樣速度、料斗間隙等。
（1）遮光度
遮光度大小，反應(yīng)的是進樣量的多少。進樣量太少，遮光度過低，取樣代表性不足；進樣量太高，遮光度過高，多重衍射導致結(jié)果偏小。干法分散，通常遮光度穩(wěn)定在0.5~6%。
（2）進樣速度和料斗間隙
樣品的進樣狀態(tài)，受進樣速度和料斗間隙影響，主要取決于顆粒粉末本身的流動性。一般設(shè)置料斗間隙為1.0mm，或根據(jù)樣品流動狀態(tài)調(diào)節(jié)。進樣速度通常手動從低到高調(diào)節(jié)，直到獲得一個平滑穩(wěn)定的流動，保證遮光度在測量范圍內(nèi)，同時滿足測量過程樣品的需求量，保證清潔系統(tǒng)時無大量殘留樣品。
（3）分散氣壓
選擇最佳的分散氣壓，保證顆粒既能避免發(fā)生團聚，又避免顆粒被高壓破碎。通過壓力滴定，改變分散氣壓做一系列重復實驗，可以判定合適的分散氣壓。
a、從高壓做到低壓，考察壓力變化對粒徑的影響
b、一般從4bar-3bar-2bar-1bar-0.5bar甚至于不加壓力
c、如有必要，可先通過顯微鏡觀察樣品形態(tài)，確定初始壓力范圍
示例：如下圖，分散氣壓過小，樣品沒有充分分散，測定數(shù)據(jù)偏大；分散氣壓過大，可能造成對樣品的破壞（氣流粉碎效應(yīng)）?？蛇x擇1.5~2bar（平臺期）作為分散氣壓，大于2bar出現(xiàn)氣流粉碎效應(yīng)。
3、其他事項
濕法測定和干法測定開發(fā)過程中，均需要注意激光粒度分布儀類型、顆粒類型、光學參數(shù)（顆粒折射率/吸收率）、測量時間、分析模型、結(jié)果類型、粒度分級等。這些項目可能不需要考察，但應(yīng)注明相關(guān)信息。在進行方法轉(zhuǎn)移時，這些項目可能會影響粒度測定的結(jié)果。
二、 分析方法驗證
方法驗證是指通過實驗室研究確定該程序滿足預期分析應(yīng)用的過程。由于粒度測定方法的獨特特征，粒度測定方法的驗證與ICH指南Q2A和Q2B和USP通則<1225>中描述的其他分析方法的驗證不同。一般來說，粒度測定方法的驗證通常涉及精度（重復性和中間精度）和耐用性的評估。其他ICH定義的驗證參數(shù)，如特異性、線性度、范圍、準確度、檢出限和定量限，通常不需用于顆粒測定方法的驗證。粒度分析方法驗證，建議驗證重復性、中間精密度和方法耐用性。
1、重復性
對樣品進行重復性驗證。由一名分析人員平行制備6份樣品測定，在同一天內(nèi)測試。計算D10、D50、D90的相對標準偏差（RSD）。
2、中間精密度
兩名分析人員，在不同時間，分別對同一份樣品，各平行制備6份樣品測定，在同一臺或不同儀器設(shè)備上測試。分別計算6次測定結(jié)果的D10、D50、D90的相對標準偏差（RSD），并計算測定結(jié)果總共12個測試結(jié)果的相對標準偏差（RSD）。
如樣品與“重復性”項下為同一樣品，其中一人的數(shù)據(jù)可以采用“重復性”項下的測定結(jié)果。
3、耐用性
耐用性是指在測試條件有小的變動時，測定結(jié)果不受影響的承受程度，即方法參數(shù)故意進行微小變化后，方法仍能保持不受影響的能力，并提供在正常范圍內(nèi)使用的可靠性說明。耐用性的評估在方法開發(fā)階段就應(yīng)該被考慮。
對光散射法，建議對以下幾項方法參數(shù)進行耐用性驗證：
（1）進樣濃度，即樣品量
（2）分散氣壓（干法測試）
（3）超聲和攪拌速度（濕法測試）
當故意小幅改變方法參數(shù)時，測試結(jié)果應(yīng)顯示可靠性。
三、 標準
《中國藥典》2020版四部通則“0982粒度和粒度分布測定法”收錄了第三法（光散射法），僅對儀器的一般要求和測定法進行了簡單介紹。USP<429>和EP 2.9.31基于ISO 13320-1(1999)和9276-1(1998)開發(fā)的，國內(nèi)有相應(yīng)的中文版GB/T 19077.1粒度分析-激光衍射法和GB/T 15445.1粒度分析結(jié)果的表述。儀器校準和確認的主要差別為：
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標準
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USP<429>
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EP 2.9.31
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ChP 2020
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GB/T 19077.1
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ISO 13320-2009
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重復性（系統(tǒng)確認）
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標準粒子
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合適的標準物質(zhì)
|
合適的標準物質(zhì)
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粒子最大粒徑與最小粒徑比約10:1
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顆粒大小直徑之比10:1
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x90/x10=1.5-10
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測量次數(shù)
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/
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6
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5
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5
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≥3
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D（50）
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RSD ≤10%
|
RSD ≤10%
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偏差及RSD ≤3%
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RSD ≤3%
|
RSD ≤3%
|
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D（10）
D（90）
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RSD ≤15%
|
RSD ≤15%
|
偏差及RSD≤5%
|
RSD ≤5%
|
RSD ≤5%
|
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粒徑小于10μm
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RSD翻倍
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RSD翻倍
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偏差及RSD翻倍
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RSD翻倍
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RSD翻倍
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準確度（校準）
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標準粒子
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認證標準物質(zhì)
|
認證標準物質(zhì)
|
/
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標準物質(zhì)或有證書的物質(zhì)
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x90/x10=1.5
|
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測量次數(shù)
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≥3
|
≥3
|
/
|
≥3
|
≥3
|
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D（50）
|
RSD ≤3%
|
RSD ≤3%
|
/
|
平均值和標準值之差≤3%
|
D(10)~D(30)
RSD≤3%
|
|
D（10）
D（90）
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RSD ≤5%
|
RSD ≤5%
|
/
|
平均值和標準值之差≤5%
|
D(30)~D(70)
RSD≤2.5%
|
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RSD翻倍
|
RSD翻倍
|
RSD翻倍
|
/
|
翻倍
|
D(70)~D(90)
RSD≤4%
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目前NMPA尚未應(yīng)用第三法進行API粒度分析方法開發(fā)和驗證的相關(guān)指導原則。粒度的評價指標一般為D10、D50、D90。建議方法開發(fā)與驗證時可參照USP<429>和EP 2.9.31的要求，RSD(D10)≤15%，RSD(D50)≤10%，RSD(D90)≤15%；當粒徑小于10μm時，RSD值可以翻倍。當然，也可根據(jù)物料自身情況，合理制定標準。
參考文獻：
EP 2.9.31 Particle size analysis by laser light diffraction
USP429 LIGHT DIFFRACTION MEASUREMENT OF PARTICLE SIZE
GB/T 19077.1-2008/ISO 13320-1：1999.粒度分析 激光衍射法 第1部分：通則
GB/T 15445.1-2008《粒度分析結(jié)果的表述 第1部分:圖形表征》
ISO 13320-2009. Particle size analysis — Laser diffraction methods
Zhigang Sun, Ph.D. Particle Size Specifications for Solid Oral Dosage Forms：A Regulatory Perspective. American Pharmaceutical Review
京公網(wǎng)安備11010802046783號
