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近日，江蘇先聲醫(yī)療器械有限公司研發(fā)的“人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質(zhì)譜法) ”獲批上市，下面嘉峪檢測網(wǎng)與您一起了解一下人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質(zhì)譜法)在臨床前研發(fā)階段做了哪些實驗。

1、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質(zhì)譜法)的主要組成成分

產(chǎn)品主要組成成分見下表 

2、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質(zhì)譜法)的預(yù)期用途

本產(chǎn)品用于體外定性檢測人外周血樣本中的CYP2C19基因681位點 G>A、636 位點 G>A 和-806 位點 C>T 的多態(tài)性。 本產(chǎn)品用于氯吡格雷的用藥指導(dǎo)。本產(chǎn)品不能預(yù)測患者 對氯吡格雷的應(yīng)答情況，僅能輔助醫(yī)生確定氯吡格雷治療策略。本產(chǎn)品檢測結(jié)果僅供臨床參考，不應(yīng)作為患者是否用藥 的唯一依據(jù)，臨床醫(yī)生應(yīng)結(jié)合患者病情、療效及其他實驗室檢測指標等對本產(chǎn)品的檢測結(jié)果進行綜合判斷。

3、人CYP2C19基因分型檢測試劑盒(飛行時間質(zhì)譜法)的檢驗原理

本試劑盒采用了多重PCR擴增技術(shù)、單堿基延伸技術(shù) 及飛行時間質(zhì)譜檢測技術(shù)。根據(jù)所選擇的多態(tài)性位點設(shè)計多重PCR特異性擴增引物和延伸引物，PCR 擴增包含多態(tài)性 位點的基因序列，特異延伸引物在SNP位點上延伸1個堿基， 單堿基延伸產(chǎn)物經(jīng)特定處理后與芯片基質(zhì)共結(jié)晶，瞬時（10-9s) 強激光激發(fā)，基質(zhì)將吸收的激光脈沖能量轉(zhuǎn)移給待 測樣本，在飛行時間質(zhì)譜檢測系統(tǒng)中按質(zhì)荷比加以分離。離子捕獲儀收集并儲存脈沖信號，自動對其進行質(zhì)譜分析。在確定的分子量范圍（理論分子量±5Da）自動進行信噪比（SNR）值分析并通過SN 值的陽性判斷值來判斷待測樣本的基因型。

4、腹腔內(nèi)窺鏡手術(shù)機器人的主要原材料

（1）主要原材料的選擇

本產(chǎn)品主要原材料包括：PCR Enzyme、10×PCR Buffer、 MgCl2，25mM、dNTP Mix、Shrimp Alkaline Phosphatase、SAP Buffer、iPLEX Pro Enzyme、Buffer Plus(10×)、384 Termination Mix、引物、質(zhì)粒、gDNA。主要原材料均為外購，引物、質(zhì)粒由開發(fā)人自行設(shè)計，由專業(yè)的合成公司合成。開發(fā)人制定了各主要原材料質(zhì)量要求并經(jīng)檢驗合格。

（2）企業(yè)參考品和質(zhì)控品設(shè)置情況

開發(fā)人設(shè)計了完整的企業(yè)參考品，包括：8 份基因型參考品，4份陰性參考品，5份檢出限參考品，3份精密度參考品。 參考品采用臨床樣本和質(zhì)粒樣本制備而成。

8份基因型參考品中7份來源于不同基因型的臨床樣本， 1份來源于質(zhì)粒樣本。4份陰性參考品中1份來源于臨床樣 ，其余3份為各包含了 CYP2C19*7/10、CYP2C9*2、 CYP2C9*3 序列的混合質(zhì)粒樣本。5 份檢出限參考品中 4 份來源于不同基因型的臨床樣本，1 份來源于質(zhì)粒樣本。3 份精密度參考品均來源于不同基因型的臨床樣本。所有參考品 7 原材料均通過一代測序確認基因型。各項企業(yè)參考品綜合用于產(chǎn)品檢測準確性、精密度和檢出限的評價。

試劑盒包含1份陽性對照品和1份陰性對照品，用于檢測過程的質(zhì)量控制。陰性對照品為人gDNA，陽性對照品為質(zhì)粒，陽性對照品涵蓋該產(chǎn)品可檢出的3個代表性的突變類型，陰性對照品為野生型樣本。

5、腹腔內(nèi)窺鏡手術(shù)機器人的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系研究

開發(fā)人通過功能性試驗確定最佳的生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體 系，包括：PCR 擴增反應(yīng)體系中 PCR 引物、dNTP、PCR 酶的用量，PCR 退火溫度、PCR 循環(huán)數(shù)；酶解反應(yīng)體系中 SAP 酶的用量，酶解時間；延伸反應(yīng)體系中延伸引物、延伸終止 液、延伸反應(yīng)酶的用量，延伸反應(yīng)溫度、循環(huán)數(shù)。同時通過 臨床樣本確定了最優(yōu)提取試劑盒、最佳 DNA 上樣量和 DNA 純度，確定了配套的樹脂芯片，確定了飛行時間質(zhì)譜檢測系 統(tǒng)最佳的檢測參數(shù)，確定了最大檢測量及避免交叉污染的方式。

6、腹腔內(nèi)窺鏡手術(shù)機器人的分析性能評估

本產(chǎn)品分析性能包括準確度、檢出限、檢測上限、精密度、分析特異性（干擾實驗、交叉反應(yīng)）、適用的抗凝劑。 開發(fā)人開展了六批產(chǎn)品在適用機型上的性能評估。 采用 8 份基因型參考品，4 份陰性參考品，5 份檢出限參考品，3 份精密度參考品對本產(chǎn)品進行檢驗，結(jié)果均符合要求。 在準確度研究中，開發(fā)人采用本產(chǎn)品與 Sanger 測序進行比較研究試驗，使用至少三批試劑盒檢測 29 份不同濃度 （15-60ng/μL）的臨床樣本，臨床樣本包含野生型和所有多態(tài)性位點的雜合突變、純合突變。結(jié)果顯示兩種檢測方法的符合率為 100%，表明兩種方法具有較好的一致性。

在檢出限研究中，開發(fā)人使用至少三批試劑盒進行評估。采用 5 例臨床樣本，分別進行梯度稀釋，對系列濃度樣 本分別進行3次重復(fù)檢測，初步選擇15ng/μL和20ng/μL 作 為進一步研究的濃度。采用 5 例臨床樣本，分別稀釋至 15ng/ μL 和 20ng/μL ，對此濃度樣本分別進行 20 次重復(fù)檢測， 以陽性檢出率≥95%的最低基因組濃度作為檢出限，最終確定該產(chǎn)品檢出限濃度為15ng/μL。

在檢測上限評估中，開發(fā)人使用至少三批試劑盒進行評估。開發(fā)人從 62 例臨床樣本中選取濃度最高的 5 例臨床樣本分別進行 3 次重復(fù)檢測，檢測符合率為 100%的最高的兩個濃度梯度再分別進行 20 次重 復(fù)檢測。結(jié)果顯示上樣濃度高達 388ng/μL，申報試劑盒仍能準確檢出，未出現(xiàn)非特異的結(jié)果。

在精密度研究中，開發(fā)人采用 5 份臨床樣本分別稀釋為檢出限濃度和中濃度，分別評價了本產(chǎn)品批內(nèi)、批間、檢測 輪次內(nèi)（日內(nèi)）、檢測輪次間（日間）、儀器、地點、操作者； 提取試劑盒批內(nèi)、批間等連續(xù) 21 天的精密度，結(jié)果顯示檢 9 測結(jié)果符合率均為 100%。本產(chǎn)品批內(nèi)、批間、日內(nèi)、日間精密度，提取試劑盒批內(nèi)、批間精密度以及不同操作者、不 同地點、不同儀器之間的精密度均較好，試劑性能穩(wěn)定。

在干擾研究中，開發(fā)人使用至少三批試劑盒對各種可能的內(nèi)源性及外源性干擾物質(zhì)進行評價。結(jié)果顯示：血液樣本中可能存在的內(nèi)源性干擾物質(zhì)血紅蛋白、甘油三酯、膽紅素、 白蛋白濃度分別為 200g/L、37 mmol/L、342μmol/L、60g/L 時 對本試劑不產(chǎn)生干擾。外源性干擾物質(zhì) EDTA-Na2、 EDTA-K2、氯吡格雷、替格瑞洛、阿司匹林，濃度分別為 25 mmol/L、2.2mg/mL、300ng/mL、627ng/mL、300ng/mL 時對本試劑不產(chǎn)生干擾。

在交叉反應(yīng)研究中，開發(fā)人使用至少三批試劑盒對臨床樣本、混合大腸桿菌 DNA 的臨床樣本、以及具有 CYP2C19 的其他突變序列、CYP2C9 基因序列等同源序列的多份混合 樣本進行檢測，檢測結(jié)果均與 Sanger 測序結(jié)果一致，符合率 100%。結(jié)果顯示檢測靶點之間不產(chǎn)生交叉反應(yīng)，上述外源 DNA、同源序列與檢測靶點之間均不產(chǎn)生交叉反應(yīng)。

在適用的抗凝劑研究中，開發(fā)人采用 27 份臨床樣本進 行三種抗凝劑采血管的適用性研究。結(jié)果顯示 EDTA 抗凝劑 采血管為最佳選擇。

7、腹腔內(nèi)窺鏡手術(shù)機器人的陽性判斷值研究

開發(fā)人采用已知基因檢測結(jié)果的 99 份樣本通過 ROC 曲 10 線分析獲得陽性判斷值為 SNR≥5。之后采用 132 例臨床樣本 進行陽性判斷值適用性的驗證，結(jié)果顯示檢測結(jié)果與 Sanger 測序結(jié)果符合率為 100%。因此陽性判斷值設(shè)置合理。

8、腹腔內(nèi)窺鏡手術(shù)機器人的穩(wěn)定性研究

開發(fā)人使用三批試劑盒對本產(chǎn)品在實際儲存條件下保存至成品有效期后的效期穩(wěn)定性、開瓶穩(wěn)定性、反復(fù)凍融穩(wěn)定性、運輸穩(wěn)定性、樣本穩(wěn)定性進行了系統(tǒng)的研究，確定了在各種條件下試劑的有效保存時間，反復(fù)凍融次數(shù)，樣本保存溫度和時間。

效期穩(wěn)定性：開發(fā)人采用三批次試劑儲存于-20±5℃條 件下，分別在 0、1、3、5、7、9、12、14 個月進行外觀檢 查、基因型參考品符合率、檢出限和精密度檢測，確定試劑 在-20±5℃條件下，可穩(wěn)定保存 12 個月。

開瓶穩(wěn)定性：開發(fā)人采用一批試劑在室溫下融化，試劑充分融化后，開蓋 10 min，然后蓋好試劑，-20±5℃條件下 儲存。分別在 0、1、2、3、4.5、5.5 和 6.5 個月的時間點取 出，進行外觀檢查、基因型參考品符合率、檢出限和精密度 檢測，確定試劑開瓶穩(wěn)定性在-20±5℃條件下，可穩(wěn)定保存 6 個月。

反復(fù)凍融穩(wěn)定性：開發(fā)人采用一批試劑進行反復(fù)凍融， 分別在凍融次數(shù) 1、2、3、4、5、6 次時，進行外觀檢查、 基因型參考品符合率、檢出限和精密度檢測，確定試劑盒在 11 使用過程中可反復(fù)凍融 5 次。

運輸穩(wěn)定性：開發(fā)人采用一批試劑進行不同路線冷鏈往 返運輸，最終確定試劑盒的運輸要求為采用保溫箱運輸（-20 ±5℃），運輸時間不超過 3.5 天。

樣本穩(wěn)定性：開發(fā)人采用 20 份臨床樣本在-20±5℃下保 存 0、2、3、4.5、5.5、6.5 個月時，分別進行檢測；采用 4 份臨床樣本在 2~8℃下保存 0、2、4、7、9 天時，分別進行 檢測。檢測結(jié)果與 Sanger 測序結(jié)果進行比對，結(jié)果顯示樣本 在 2~8℃可保存一周，-20±5℃可保存 6 個月。