熒光顯納技術(shù)提供了克服光學(xué)顯微鏡中衍射極限分辨率障礙的成像技術(shù)，開辟了生物醫(yī)學(xué)成像研究領(lǐng)域（尤其在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域）。與傳統(tǒng)顯微鏡不同，熒光顯納鏡提供了一種實現(xiàn)基因組規(guī)模成像的有前景的方法，可以產(chǎn)生細(xì)胞行為和功能的分子基礎(chǔ)全景圖；同時結(jié)合光學(xué)方法、精確建模和對大腦深處神經(jīng)活動的操縱等手段，熒光顯納技術(shù)將繼續(xù)推動神經(jīng)科學(xué)的發(fā)展。
中國工程院外籍院士顧敏等研究人員在中國工程院院刊《Engineering》2022年第9期發(fā)表《熒光顯納鏡在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用》一文，詳細(xì)介紹了熒光顯納技術(shù)的應(yīng)用進展，描述了其在闡明蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和流動性、神經(jīng)活動過程中涉及突觸參數(shù)的實時測定、三維成像和納米級神經(jīng)活動跟蹤等方面的應(yīng)用。文章還討論了熒光顯納鏡的發(fā)展前景，特別關(guān)注其在神經(jīng)科學(xué)中與相關(guān)技術(shù)（如機器學(xué)習(xí)）的結(jié)合方面的未來發(fā)展方向。
一、引言
神經(jīng)科學(xué)的范圍包括對神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)及其在產(chǎn)生行為中的功能的科學(xué)研究。從宏觀的角度來看，神經(jīng)系統(tǒng)包括分布在大腦中許多離散解剖位置的神經(jīng)元和回路，并服務(wù)于三種功能之一：感覺、運動和聯(lián)想。在納米尺度上，相關(guān)突觸蛋白的組織對于神經(jīng)元過程的穩(wěn)定性和功能至關(guān)重要，比如神經(jīng)元信號傳遞。例如，在化學(xué)突觸的信號傳遞過程中，由動作電位（AP）到達引起的突觸前Ca2+濃度升高（與突觸拮抗素相關(guān)）導(dǎo)致神經(jīng)遞質(zhì)釋放，接著可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體（SNARE）復(fù)合物將兩個膜結(jié)合在一起。精細(xì)的基于蛋白質(zhì)的細(xì)胞基質(zhì)在釋放過程中起著重要作用。網(wǎng)格蛋白還參與囊泡從質(zhì)膜的內(nèi)吞出芽。
除了蛋白質(zhì)流動性外，蛋白質(zhì)分布在神經(jīng)元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中也發(fā)揮著不同的功能作用。例如，突觸以興奮性突觸后電流（EPSC）或抑制性突觸后電流（IPSC）形式傳遞的信息在軸突的前端處被整合和“讀出”。此外，EPSC模型反映了易于釋放池的初始大小及其從儲備池中的補充率、突觸小泡（SV）釋放的概率和突觸易化。軸突具有獨特的細(xì)胞骨架，其中包含肌動蛋白和血影蛋白等蛋白質(zhì)，以及影響其功能完整性的相關(guān)蛋白質(zhì)。膜相關(guān)周期性骨架（MPS）可能影響軸突中AP和其他信號通路的產(chǎn)生和信號傳播。
熒光顯微鏡是生物學(xué)領(lǐng)域最流行的成像技術(shù)，因為它在使用熒光標(biāo)記的分子特異性標(biāo)記方面具有優(yōu)勢，并且具有實時成像能力。由于光的衍射極限，使用傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡無法在納米級解析蛋白質(zhì)遷移率和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如突觸。近年來，已經(jīng)出現(xiàn)了幾種形式的熒光顯納鏡，它們的成像分辨率是傳統(tǒng)熒光顯微鏡的2~100倍。熒光顯納技術(shù)提供了一種功能強大的新型成像工具，其分辨率與電子顯微鏡相似；同時，它具有適合研究亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生物過程的一定優(yōu)勢，包括活細(xì)胞、多色、實時和三維（3D）分子成像，以及跟蹤能力。結(jié)合其他尖端技術(shù)，熒光顯納技術(shù)為更好地了解神經(jīng)元、神經(jīng)元回路以及最終神經(jīng)系統(tǒng)的功能提供了一條途徑。
在本文中，我們總結(jié)了幾種熒光顯納鏡技術(shù)：結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）、受激發(fā)射損耗（STED）顯微鏡、隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（STORM）/光敏定位顯微鏡（PALM）和最小輻射通量（MINFLUX）顯納鏡，它結(jié)合了STED顯微鏡和STORM。然后，我們從分子和細(xì)胞神經(jīng)科學(xué)的角度討論這些技術(shù)的高級應(yīng)用。最后，我們總結(jié)熒光顯納鏡在神經(jīng)科學(xué)中的前景。
二、熒光和衍射極限
（一）熒光原理
熒光團是一種可以吸收“基態(tài)”光子的熒光化合物，在“激發(fā)態(tài)”導(dǎo)致熒光發(fā)射和振動弛豫。從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的轉(zhuǎn)變非常迅速（超過飛秒）。了解發(fā)射和吸收過程的最有用的方法之一是Jablonski圖（圖1）。單重態(tài)是由在單個狀態(tài)內(nèi)具有相反自旋的電子的磁矩抵消引起的。三重態(tài)的壽命相對較長。S0表示基態(tài)，S1和S2表示激發(fā)單重態(tài)。S2是比S1高的能態(tài)，而S0是比S1低的能態(tài)。
圖1. Jablonski圖說明熒光分子內(nèi)的能量狀態(tài)。S0是基態(tài)；S1和S2是激發(fā)單重態(tài)；T0和T2分別是三重態(tài)。
由于熒光的斯托克斯位移，即發(fā)射光的波長相對于吸收光的紅移波長，熒光顯微鏡中的信噪比之間的對比度得到了顯著改善。此外，熒光顯微鏡的基本原理，即用激發(fā)波長照射染色樣品并在更長的發(fā)射波長上檢測其熒光信號，很容易理解。
（二）衍射極限的影響
光學(xué)顯微鏡可以被視為一種透鏡系統(tǒng)，可用于觀察樣本中的精細(xì)結(jié)構(gòu)。由于光的衍射，因此3D點擴散函數(shù)（PSF）具有有限的大小?；诳臻g中的相長干涉，PSF 的半高峰寬（FWHM）?r≈λ/(2n×sinα)位于焦平面內(nèi)，并且Δl≈λ/(n× sin2α)沿光軸。在這里，λ、α和n分別表示光的波長、物鏡的孔徑角和浸沒介質(zhì)的折射率；?r是PSF在橫向上的FWHM；Δl是PSF在軸向上的FWHM。如圖2所示，當(dāng)使用可見光（λ=632.8 nm）和數(shù)值孔徑（NA）為1.40（NA=n ×sinα）的油浸物鏡成像時，PSF的橫向尺寸約為226 nm，PSF的軸向尺寸約為487 nm。光的衍射極限導(dǎo)致無法解析的分子結(jié)構(gòu)，因此細(xì)胞的納米級基本機制仍然不可見。
圖2. NA = 1.40油浸物鏡的PSF。激發(fā)波長為632.8 nm。
三、熒光顯納技術(shù)
自20世紀(jì)中葉以來，已經(jīng)引入了幾個概念，包括共焦熒光顯微鏡和多光子顯微鏡，以減少離焦熒光背景和光學(xué)斷層成像的能力。原則上，與傳統(tǒng)熒光顯微鏡相比，共聚焦熒光顯微鏡將空間分辨率提高倍。實際上，由于探測器尺寸有限，它們是相同的。共焦單光子和雙光子熒光顯微技術(shù)提供幾乎相同的分辨率。通過擴展照明或探測波前，4Pi顯微鏡可以在固定細(xì)胞中實現(xiàn)80~150 nm的橫向分辨率?；谀獱栃?yīng)，SIM將高頻特征轉(zhuǎn)換為低頻特征，進而被顯微鏡探測到。SIM提供了100~120 nm的橫向分辨率和約300 nm的軸向分辨率。然而，分辨率仍然受到衍射極限的限制。
熒光團光物理和光化學(xué)方面，取得最顯著突破的技術(shù)是STED顯微鏡和STORM/PALM，這兩種技術(shù)都通過依次讀取衍射區(qū)的分子熒光特征來打破衍射屏障。具體來說，讀出標(biāo)記是指提供“明亮狀態(tài)”的信號，同時將其他標(biāo)記保持在“黑暗狀態(tài)”。最近，結(jié)合這兩種技術(shù)的優(yōu)勢，MINFLUX顯納鏡為生物學(xué)研究提供了更強大、更通用的成像工具，在固定細(xì)胞和活細(xì)胞中實現(xiàn)了1~3 nm的分辨率。圖3顯示了SIM、STED顯微鏡、STORM/PALM和MINFLU顯納鏡的成像原理。與STORM/PALM類似，MINFLUX顯納鏡只對單個（或至少可識別的）分子進行成像。換句話說，與MINFLUX顯納鏡和STORM/PALM不同，STED顯微鏡主要讀取熒光基團，依賴于暗態(tài)和亮態(tài)之間的可逆轉(zhuǎn)換。
圖3. SIM、STED顯微鏡、STORM/PALM和MINFLUX顯納鏡的工作原理和分辨率。使用正弦照明模式，在傅里葉域中SIM可以恢復(fù)正常觀察區(qū)域大小兩倍的信息。換句話說，SIM在空間域（100~120 nm）中獲得兩倍的正常分辨率。典型的單點掃描STED顯微鏡使用環(huán)形STED光束（橙色）淬滅激發(fā)光束（藍色）。PALM和STORM隨機讀取單個分子。N >> 1光子允許對衍射點內(nèi)的單個分子進行質(zhì)心計算。紫色斑點表示給定目標(biāo)（白星）范圍的衍射點。使用可調(diào)環(huán)形光束，目標(biāo)坐標(biāo)圖案包括四個指定坐標(biāo)（顯示為黑色、紅色、黃色和藍色圓圈）。I：“STED光束”的峰值強度；IS ：熒光基團的飽和強度；N：熒光基團位置的光子數(shù)；L：圓環(huán)圖案大?。籲0和n1是在分別在圓環(huán)位置r0和r1處熒光光子計數(shù)；1D：一維；r0、r1、r2和r3分別是甜甜圈位置。
（一）結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡
結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡（SIM）使用圖案照明場，結(jié)合光學(xué)操作和計算算法來獲得光學(xué)斷層成像并促進 3D成像。在空間域中，在線性不變光學(xué)系統(tǒng)中觀測數(shù)據(jù)可以表示為發(fā)射物和點擴散函數(shù)（PSF）H卷積：D(r) =E(r)⊗H(r)，其中，r是定位位置。相比之下，卷積可以在傅里葉域中表示為逐點乘積，
，其中，O是光學(xué)傳遞函數(shù)（OTF），k是空間頻率。OTF定義了顯微鏡可以探測到的空間頻率或可觀察區(qū)域。如圖3所示，使用具有不同相位和方向的周期性照明圖案的總和，可以在橫向和軸向方向上提高所重建的發(fā)射物圖像的分辨率。
（二）受激輻射損耗顯微鏡
在20世紀(jì)90年代，提出了受激輻射損耗（STED）顯微鏡的概念，在遠(yuǎn)場中使用傳播光和常規(guī)透鏡。使用時序圖案照明，是確定亮標(biāo)記坐標(biāo)的最直接方法。該技術(shù)可以被視為可逆飽和光學(xué)線性熒光躍遷（RESOLFT）。除STED顯微鏡外，RESOLFT指基態(tài)耗盡顯微鏡。如圖3所示，基于共聚焦顯微鏡配置，熒光標(biāo)記由聚焦的激發(fā)光束激發(fā)。在熒光團的自發(fā)衰減中，激發(fā)光束和STED顯微鏡光束的重疊會產(chǎn)生亞衍射點。STED顯微鏡的實際分辨率為
。在這里，I是“STED光束”的峰值強度，Ιs是熒光團的飽和強度。為了提高分辨率，由螺旋空間相位調(diào)制器或渦旋相位板產(chǎn)生的紅移環(huán)形STED光束的強度必須滿足Ι>Is。換句話說，STED顯微鏡的分辨率僅由STED光束決定。通過增加STED光束的強度，有效光斑的直徑被限制在20 nm的橫向分辨率。盡管如此，為了避免光漂白，必須采用合適的染料和自適應(yīng)照明技術(shù)。
（三）隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡/光敏定位顯微鏡
與STED顯微鏡中選擇的坐標(biāo)相比，在隨機光學(xué)重構(gòu)顯微鏡（STORM）、光敏定位顯微鏡（PALM）和納米尺度點累積形貌成像（PAINT），單個熒光分子從隨機坐標(biāo)中讀出（圖3）。使用寬視場照明，打開或激活單個分子。下一個活化分子與前一個活化分子的距離為λ/2n。分子的重復(fù)激發(fā)在相機上形成一個放大的衍射點。然后通過用于切換和非切換熒光團的暗-亮-暗狀態(tài)機制逐個分子組裝圖像。檢測到的光子能夠定位點的質(zhì)心位置并確定分子的橫向位置。STORM/PALM的光學(xué)分辨率約為
，其中，N是熒光團位置的光子數(shù)。值得一提的是，高質(zhì)量的STORM圖像要求熒光團具有每次切換事件的高光子產(chǎn)量、低開關(guān)占空比、高存活率和多個切換周期。在這些特性中，低開關(guān)占空比可以最大化熒光密度，這等同于實現(xiàn)奈奎斯特標(biāo)準(zhǔn)允許的最大成像分辨率。然而，激活光不會改變每個開關(guān)事件檢測到的光子數(shù)。
（四）最小輻射通量顯納鏡
2017年，Stefan Hell實驗室提出了一種名為最小輻射通量（MINFLUX）顯納鏡的定位概念。這種技術(shù)將結(jié)構(gòu)光照明與單分子特征（如在STORM/PALM中）相結(jié)合，以獲得目標(biāo)分子的坐標(biāo)（如在STED顯微鏡中）。MINFLUX納米顯微鏡具有先進的3D多色分子成像和跟蹤功能，可在可擴展的視場（FOV）中獲得迄今為止未實現(xiàn)的個位數(shù)納米精度和大約100 µs時間分辨率。如圖3所示，MINFLUX顯納鏡采用可移動的激發(fā)光束，其中心的強度最小。該最小值用作參考坐標(biāo)，發(fā)射光子的數(shù)量隨著接近熒光團而減少。因此，與STED顯微鏡和STORM/PALM不同，MINFLUX顯納鏡不需要大量的光子。
MINFLUX顯納鏡裝置包括一個在大約400 nm激活區(qū)域內(nèi)激活熒光團的激活光束和一個定位或跟蹤分子的激發(fā)光束。對于每個定位，首先聚焦光束；然后，一個調(diào)制的二維（2D）或3D甜甜圈圖案，具有逐漸縮小的直徑（L），在焦平面（x, y）或體樣品（x, y, z）中利用最大似然估計來定位或跟蹤分子。在一維中，定位的最小標(biāo)準(zhǔn)偏差，即區(qū)域L內(nèi)的Cramer-Rao界（CRB）是
，其中，σ是定位位置，N=n1+n0是在甜甜圈圖案中不同位置（r0 和r1）處檢測到的光子數(shù)。在激活區(qū)域內(nèi)，僅N=600的光子數(shù)可以預(yù)期一維精度為(σ-1) nm。因此，MINFLUX納米顯微鏡的迭代精度超過了基于量子CRB（QCRB）的相機定位的橫向精度。
除了直接克服光的衍射極限的熒光顯納鏡之外，擴展顯微鏡（ExM）可以通過組織和器官標(biāo)本的物理放大，即使使用傳統(tǒng)的衍射極限顯微鏡，也可以實現(xiàn)納米級3D成像。在過去的幾年中，已經(jīng)提出了各種ExM方案，用于蛋白質(zhì)和核糖核酸（RNA）的高分辨率成像，或用于人類臨床標(biāo)本。為了實現(xiàn)各向同性樣品膨脹，生物分子和（或）標(biāo)記首先自發(fā)耦合到聚合物網(wǎng)。然后將樣品均質(zhì)化并膨脹。ExM的分辨率可以通過使用基于水溶液的CUBIC-X進行兩輪擴展達到亞細(xì)胞水平。
四、熒光顯納技術(shù)的成像能力
在過去的幾十年里，熒光顯納技術(shù)已經(jīng)越來越適合對亞細(xì)胞動力學(xué)和結(jié)構(gòu)的生命系統(tǒng)進行3D、多色和納米級分辨率的成像。以商業(yè)STED顯微鏡為例：STEDINFINITY [Abberior Instruments (AI)，德國]線在2D和3D中可以分別達到小于20 nm×20 nm和小于70 nm×70 nm×70 nm的橫向分辨率。再加上100×物鏡，F(xiàn)OV為80 µm × 80 µm。使用QUADScanner [Abberior Instruments (AI)，德國]，對于512像素×512像素圖片，行頻最高可達2.6 kHz，數(shù)據(jù)采集速度可達每秒4.2幀。使用自適應(yīng)光學(xué)可以在果蠅幼蟲等復(fù)雜樣品內(nèi)實現(xiàn)高達100 µm的成像深度。為了減少光漂白和光毒性，具有Dymin成像模式的STED顯微鏡同時將光劑量最小化并將信號增強一個數(shù)量級。
空間和時間分辨率之間的權(quán)衡在高分辨率成像技術(shù)中是不可避免的，尤其是在熒光顯納鏡中。STED顯微鏡可以毫秒的時間分辨率對相對較小的FOV進行成像。配備快速切換染料和快速互補金屬氧化物半導(dǎo)體（CMOS）相機，STORM可以在約20~30 nm空間分辨率下實現(xiàn)亞秒級時間分辨率，用于活細(xì)胞成像中的大FOV。此外，在STED顯微鏡和STORM/PALM中，光漂白和（或）光毒性可以大大降低。憑借其低光毒性，圖案化激活非線性SIM（PA NL-SIM）在具有數(shù)十個時間點的大FOV上展示了具有大約60 nm的空間分辨率和亞秒級時間分辨率的活細(xì)胞成像。在MINFLUX納米鏡中，超精確的2 nm空間分辨率和100 kHz時間分辨率可以通過其最小的光子預(yù)算（即固定和活細(xì)胞的低光漂白/光毒性）和可擴展的FOV來實現(xiàn)。
五、熒光顯納技術(shù)在神經(jīng)科學(xué)中的應(yīng)用
盡管熒光顯納技術(shù)在活性區(qū)（AZ）中提供了非常精細(xì)的結(jié)構(gòu)信息（如密集蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞區(qū)室），但不同分子結(jié)構(gòu)的特定生理特性仍然是一項重大挑戰(zhàn)。熒光顯納鏡主要用于研究結(jié)構(gòu)（如MPS和蛋白質(zhì)的功能），特別是在終端棒頭中[如突觸前AZ和突觸后密度（PSD）]。由于組織和光的特性，動態(tài)、活細(xì)胞和體內(nèi)深部組織成像仍然具有挑戰(zhàn)性。由于STED顯微鏡提供活細(xì)胞跟蹤功能，因此動態(tài)揭示了神經(jīng)元傳遞過程中的突觸融合。
（一）突觸中蛋白質(zhì)的空間組織
基于蛋白質(zhì)的細(xì)胞基質(zhì)在AZ（CAZ）中對于促進SV釋放過程至關(guān)重要。Rab亞科Rab3相互作用分子（RIM）結(jié)合蛋白（RBP）是AZ支架的引物效應(yīng)子。因此，RBP家族對于果蠅中SVs、Ca2+通道和SV融合機制的耦合是必不可少的。雙色STED顯微鏡已證明基于RBP的細(xì)胞基質(zhì)在控制易于釋放的SV數(shù)量方面具有直接作用。如圖4（a）所示，果蠅RIM結(jié)合蛋白（DRBP）圍繞著中央Ca2+通道。DRBP對于AZ支架的完整性和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放至關(guān)重要。此外，根據(jù)直接STORM技術(shù)，CAZ包括含有137個Bruchpilot (Brp)蛋白的單元。這些單位的組織涉及與不同的神經(jīng)傳遞釋放概率相關(guān)的各種AZ狀態(tài)。
圖4. 突觸蛋白結(jié)構(gòu)的納米成像。（a）左圖：在果蠅神經(jīng)肌肉接頭突觸處包含DRBP、Brp和電壓門控Ca2+通道雜音（CaC）的突觸前AZ的3D STED圖像。右圖：傾斜視圖中的AZ模型。DRBP：果蠅RIM結(jié)合蛋白；Brp：Bruchpilot；GFP：綠色熒光蛋白；CacGFP：GFP標(biāo)記的Ca2+通道；GluRIID：谷氨酸受體亞基。（b）突觸的3D STORM圖像。（c）PSD-95的MINFLUX納米顯微鏡成像，3D分辨率約為2~3 nm：（i）突觸后PSD-95草圖；（ii）PSD-95呈簇狀分布在曲面上；（iii）各向同性3D定位精度為2.0~2.7 nm的單個熒光團。PSD-95：突觸后密度蛋白95。
在神經(jīng)傳遞過程中，SV在AZ膜內(nèi)融合以響應(yīng)Ca2+流入。在核心融合復(fù)合物中，有SNARE蛋白、囊泡成分和AZ特異性蛋白，所有這些都有助于SV和膜對接與融合。STED顯微鏡已用于可視化SNARE蛋白突觸蛋白、不清楚的蛋白SC35和煙堿乙酰膽堿受體。
支架蛋白如突觸后密度蛋白95（PSD-95）、鳥苷酸激酶相關(guān)蛋白、濃縮蛋白Shank3和Homer是PSD的主要成分。STORM和PALM成像都繪制了突觸前和突觸后末端蛋白質(zhì)的空間組織圖，包括突觸前支架蛋白的方向、PSD的層狀組織和神經(jīng)遞質(zhì)受體的橫向分布。圖4（b）顯示了突觸前巴松管（紅色）和突觸后Homer1（綠色）的軸向和徑向3D STORM圖像。應(yīng)該注意的是，PSD-95在突觸后膜中的谷氨酸受體錨定和重新排列方面起著至關(guān)重要的作用。例如，使用STED顯微鏡結(jié)合內(nèi)源性蛋白質(zhì)標(biāo)記，PSD-95經(jīng)常出現(xiàn)在擴展分布中，而不是作為孤立的納米簇。最近，MINFLUX納米技術(shù)表明PSD-95沿著邊長為100~400 nm的略微彎曲的表面分布，如圖4（c）所示。
（二）軸突的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)
軸突中的MPS最初是使用STORM發(fā)現(xiàn)的。據(jù)觀察，由短肌動蛋白絲構(gòu)成的肌動蛋白被組織成重復(fù)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)作為軸突束。相鄰的肌動蛋白環(huán)由血影蛋白四聚體連接，形成長程準(zhǔn)一維周期結(jié)構(gòu)。這種結(jié)構(gòu)形成于軸突膜下方，周期約為180~190 nm。然而，使用MINFLUX納米顯微鏡的研究人員最近發(fā)現(xiàn)，在空間分辨率小于2 nm時，MPS類似于軸突中的周期性螺旋結(jié)構(gòu)。此外，使用STED顯微鏡和STORM，觀察到樹突中的MPS。然而，樹突中MPS的形成傾向和生長速度似乎低于軸突中的。此外，在胞體、樹突和Ranvier的節(jié)點中觀察到由MPS成分形成的二維多邊形晶格結(jié)構(gòu)。換言之，神經(jīng)元中MPS的結(jié)構(gòu)需要進一步闡明，以破譯其促進或協(xié)助AP產(chǎn)生和傳播的功能，目前尚不清楚。
（三）囊泡融合的時間動力學(xué)
眾所周知，CAZ提供了一個在神經(jīng)傳輸和通信過程中釋放SV的功能平臺。然而，在STED顯微鏡發(fā)明之前，囊泡運動的原理是難以捉摸的，這使得海馬神經(jīng)元中SV的運動能夠被跟蹤。突觸結(jié)合蛋白用偶聯(lián)的抗體標(biāo)記Atto 647 N（ATTO-TECGmbH，德國），最終圖像的空間分辨率為62 nm，顯示面積為1.8 μm × 2.5 μm，每秒28幀。這表明囊泡不斷結(jié)合，然后以類似于“粘連擴散”模型的方式從細(xì)胞器中擴散出去。此外，IsoSTED顯微鏡已被用于在兩個內(nèi)吞作用和胞吐作用周期中跟蹤囊泡，表明相同的囊泡用于自發(fā)和受刺激的神經(jīng)遞質(zhì)釋放。然而，囊泡運輸?shù)臐撛跈C制仍然未知。STED顯微鏡還從單個SV中分離出突觸結(jié)合蛋白I，這些SV在囊泡融合時形成孤立的簇。通過用綿羊抗小鼠Atto 532染料標(biāo)記突觸結(jié)合蛋白，STED顯微鏡實現(xiàn)了更高的分辨能力，用于對SV及其密集的分子貨物進行成像。此外，在融合過程中，突觸結(jié)合蛋白仍然聚集在囊泡內(nèi)。也就是說，它在胞吐作用后不會擴散到質(zhì)膜。
（四）3D納米級神經(jīng)元成像
熒光顯納技術(shù)已經(jīng)為具有納米級空間分辨率的神經(jīng)回路成像鋪平了道路。使用STORM，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)映射已在三個維度上投影，在神經(jīng)回路尺度上提供突觸連接。在圖5（a）中，使用STORM對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（藍色）、突觸后支架蛋白 gephyrin（綠色）和突觸前蛋白（洋紅色）進行成像。使用STED顯微鏡，在體內(nèi)觀察小鼠體感皮層分子層的增強型黃色熒光蛋白（eYFP）標(biāo)記的神經(jīng)元的樹突和軸突結(jié)構(gòu)；精細(xì)神經(jīng)結(jié)構(gòu)的投影體積和脊柱形態(tài)的時間動態(tài)以67 nm的空間分辨率顯示[圖5（b）]。此外，通過結(jié)合貝塞爾光束SIM（BB-SIM）和組織清除方法，可以在整個成年果蠅大腦中識別單個mRNA（SmFISH）的定位和豐度。
圖5. 離體和體內(nèi)神經(jīng)元的納米成像。（a）視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的樣品制備和離體STORM成像。最終圖像的插圖（右下）顯示了樹突部分的放大視圖。（b）小鼠體感皮層的體內(nèi)STED成像。
六、未來研究方向
（一）MINFLUX顯納鏡
有時被稱為“諾貝爾后”熒光顯納技術(shù)，MINFLUX顯納鏡已經(jīng)為了解固定細(xì)胞和活細(xì)胞中神經(jīng)元的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能開辟了一條新的研究途徑。MINFLUX顯納鏡的一個潛在應(yīng)用是確定突觸參數(shù)和可視化突觸可塑性。確定突觸參數(shù)需要在囊泡融合或神經(jīng)遞質(zhì)釋放期間使用納米空間分辨率和微秒時間分辨率進行量化建模。持續(xù)數(shù)小時或更長時間的長期變化為學(xué)習(xí)和記憶提供了生理基礎(chǔ)，而短期變化則發(fā)生在幾毫秒到幾分鐘的時間段內(nèi)。MINFLUX顯納鏡提供超高時空分辨率以及長期活細(xì)胞跟蹤和成像能力，可實現(xiàn)精確的突觸參數(shù)建模和具有低光毒性的突觸可塑性可視化。此外，結(jié)合通過物理樣本擴展方法（ExM）進行的高分辨率成像，可以實現(xiàn)熒光顯納鏡的空間分辨率的多倍增加，尤其對MINFLUX顯納鏡。
（二）熒光生物偶聯(lián)物
熒光顯納技術(shù)的性能與熒光探針的光學(xué)特性密切相關(guān)。例如，一種名為“quick-SIMBA”的具有高時空分辨率的納米技術(shù)已經(jīng)使用一種新的光可轉(zhuǎn)換熒光蛋白（FP）pcStar開發(fā)出來，并已被用于發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的特定“平行三柱”結(jié)構(gòu)在果蠅胚胎中的膠質(zhì)細(xì)胞連接。除了內(nèi)源性熒光探針，即FP，正在開發(fā)新的外源性探針，以增加圖像亮度，提高空間分辨率，并增強熒光顯納技術(shù)中標(biāo)記的特異性，包括小分子有機染料、量子點、聚集誘導(dǎo)發(fā)射納米粒子、聚合物點和上轉(zhuǎn)換納米粒子（UCNP）。開發(fā)尺寸更小、效率更高的新型熒光探針生物偶聯(lián)物，有可能進一步提高熒光顯納技術(shù)的成像分辨率。此外，利用染料標(biāo)記的脫氧核糖核酸（DNA）探針的隨機結(jié)合，DNA-PAINT在DNA折紙納米結(jié)構(gòu)上實現(xiàn)了相似的圖像分辨率。值得一提的是，可交換熒光基團已成功用于STED，如STED-PAINT。
（三）基因組成像
神經(jīng)元的正常功能是基于多種分子的集體作用。然而，熒光團之間的光譜重疊限制了可以同時測量的分子種類的數(shù)量。最近開發(fā)的基于多重?zé)晒庠浑s交（FISH）的基因組規(guī)模成像技術(shù)極大地增加了可以同時成像并具有一定容錯性的分子種類的數(shù)量。例如，在標(biāo)記RNA分子的過程中，可以將一個特殊設(shè)計的多位二進制字編碼到熒光探針中，可以根據(jù)碼本進行探測。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組成像方法通過原位測序和FISH實現(xiàn)了單個細(xì)胞中1000多個基因的成像和多路復(fù)用。這些技術(shù)與熒光納米顯微鏡的結(jié)合可能會在分子水平上為神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)和功能提供新的見解。
（四）光學(xué)工具和其他相關(guān)成像技術(shù)
1. 光遺傳學(xué)
熒光顯納鏡是研究神經(jīng)元內(nèi)部和神經(jīng)元之間動態(tài)過程的重要工具，它涉及對大腦中特定細(xì)胞的快速和精確控制，同時不改變其他細(xì)胞。電極精度不夠高，藥物作用太慢。光遺傳學(xué)是一種結(jié)合遺傳和光學(xué)方法來激活或抑制活組織特定細(xì)胞中明確生理活動的技術(shù)。然而，可見光的穿透深度受到內(nèi)源發(fā)色團的強烈散射的限制。近紅外（NIR）光在生物組織中具有更深的穿透深度，但其波長位于光遺傳學(xué)窗口之外。UCNP可以將低能入射NIR光子轉(zhuǎn)換為高能可見發(fā)射，并且可以調(diào)整光譜以適應(yīng)不同的光激活通道。將熒光顯納鏡與UCNP介導(dǎo)的光遺傳學(xué)相結(jié)合，為大腦深處受控神經(jīng)元活動的侵入性研究提供了令人興奮的可能性。
2. 神經(jīng)元樣結(jié)構(gòu)的直接激光寫入
我們可以打印大腦嗎？這是一個有趣的問題。然而，大腦的復(fù)雜性超出了傳統(tǒng)制造技術(shù)的能力。結(jié)合直接激光寫入，熒光顯納技術(shù)可以促進仿生光子芯片的發(fā)展，從而更接近地模擬大腦功能。雙光子直接激光寫入已經(jīng)產(chǎn)生了具有亞微米特征的各種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的3D仿生神經(jīng)元結(jié)構(gòu)，而雙光束激光寫入可以制造特征小至9 nm的結(jié)構(gòu)。
3. 相關(guān)成像技術(shù)
AP的測量在神經(jīng)科學(xué)中具有重要意義。目前，使用膜片鉗的電生理學(xué)是測量單個AP的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，盡管它具有出色的時間分辨率和良好的信噪比，但空間分辨率僅限于大約10 µm。氮空位（NV）中心的光致發(fā)光隨AP在稱為光學(xué)檢測磁共振（ODMR）的過程中傳播產(chǎn)生的磁場而變化。這可以在環(huán)境條件下實現(xiàn)生物系統(tǒng)中的高分辨率磁場感應(yīng)。例如，已經(jīng)使用ODMR證明了在單個神經(jīng)元和完整生物體中檢測AP。通過結(jié)合熒光使用ODMR進行納米鏡檢查，可以在納米級空間分辨率下可視化和測量具有突觸強度變化的AP。
成像深度主要受到可見光范圍內(nèi)的強光吸收和散射的限制，因此即使在小動物中，也很難從大腦更深層次解析圖像。解決這個問題的直接方法是通過插入梯度指數(shù)（GRIN）透鏡或纖維鏡或使用微棱鏡來訪問目標(biāo)深層區(qū)域。例如，可以使用微棱鏡對組織的垂直橫截面進行成像。GRIN透鏡已用于對深部腦組織成像，包括海馬、下丘腦、丘腦和CA1海馬中的樹突棘等精細(xì)結(jié)構(gòu)。這些技術(shù)的空間分辨率是有限的；因此，結(jié)合熒光顯納鏡可以幫助實現(xiàn)全尺度的深部腦成像。
為了通過減少光吸收來提高穿透深度，多光子顯微鏡（MPM）使用更長波長的激發(fā)。三光子熒光的成像深度已被證明是小鼠腦組織表面以下5~6個有效衰減長度，對于755 nm激發(fā)，其約為130 µm。此外，已經(jīng)使用具有1280 nm激發(fā)的雙光子熒光實現(xiàn)了小鼠大腦表面下方1.2~1.6 mm的成像深度。相干拉曼散射（CRS），如受激拉曼散射（SRS）和相干反斯托克斯拉曼散射，是另一種用于深層組織成像的MPM技術(shù)。SRS已被用于檢測和成像在亞細(xì)胞和多神經(jīng)元尺度上的膜電位分布并在神經(jīng)肌肉接頭處成像神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿。盡管CRS的空間分辨率受到光衍射的限制，但基于尖端增強CRS、CRS的抑制或飽和以及高階非線性過程的方法已經(jīng)被開發(fā)來解決這個問題。未來CRS的發(fā)展可能會實現(xiàn)納米尺度的成像，并提供與熒光顯納技術(shù)互補的信息。
除了光吸收之外，光散射是限制成像深度的另一個問題，因為它會在成像過程中引入像差。自適應(yīng)光學(xué)（AO）使用有源器件，如可變形反射鏡和液晶空間光調(diào)制器（SLM），來補償波前失真，可以直接測量或間接測量。AO已應(yīng)用于單分子定位顯微鏡（如PALM和STORM）、SIM和STED顯微鏡，從而顯著提高了定位精度、圖像清晰度和亮度。預(yù)計對AO的新研究將繼續(xù)促進熒光顯納技術(shù)的進步，包括MINFLUX納米技術(shù)。
機器學(xué)習(xí)（ML）和熒光顯納技術(shù)的結(jié)合提供了另一個研究方向。最近，ML已通過散射介質(zhì)應(yīng)用于光學(xué)成像，這可能對深部腦成像有用。ML還被用于加速STORM中的數(shù)據(jù)處理并提高成像的空間分辨率。此外，ML可以與光學(xué)數(shù)字化全息（ODH）相結(jié)合，以實現(xiàn)對激發(fā)場矢量的按需定制，這可以提高熒光顯納技術(shù)的靈活性。隨著光子憶阻器的發(fā)展，其中光學(xué)特性根據(jù)透射光而變化，可以制造動態(tài)ODH用于全光神經(jīng)形態(tài)計算和高速納米成像。
七、結(jié)論
熒光顯納技術(shù)研究在過去的幾十年中發(fā)展迅速，有望推動熒光探針和標(biāo)記方法的進一步發(fā)展，以實現(xiàn)超高分辨率成像，同時降低所需的光子預(yù)算和樣品的光毒性。與傳統(tǒng)顯微鏡不同，熒光顯納顯微鏡提供了一種實現(xiàn)基因組規(guī)模成像的有前景的方法，這將產(chǎn)生細(xì)胞行為和功能的分子基礎(chǔ)的全景圖。結(jié)合其他光學(xué)方法、精確建模和對大腦深處神經(jīng)活動的操縱，熒光顯納技術(shù)將繼續(xù)徹底改變神經(jīng)科學(xué)。MINFLUX顯納鏡將實現(xiàn)體內(nèi)成像和神經(jīng)活動跟蹤，以進一步量化具有納米空間分辨率和微秒時間分辨率的突觸參數(shù)?；贛L的熒光顯納技術(shù)有可能在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)前所未有的應(yīng)用發(fā)展。由于其巨大的前景，所有形式的熒光顯納技術(shù)都將被繼續(xù)用于闡明大腦的秘密，并為人工智能的突破性發(fā)展做出貢獻。
改編原文：Yangyundou Wang,Jian Lin,Qiming Zhang,Xi Chen,Haitao Luan,Min Gu.Fluorescence nanoscopy in neuroscience [J].Engineering,2022,16(9):29-38.
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