目前在抗體類藥物的生產(chǎn)過程中，純化工藝有著非常重要的位置。從項(xiàng)目開始到抗體藥上市對(duì)于純化而言需要經(jīng)歷多個(gè)階段，例如工藝開發(fā)，工藝放大與確認(rèn)，IND臨床樣品生產(chǎn)，PC研究， PPQ以及商業(yè)化生產(chǎn)等，隨著工藝不斷的向前推進(jìn)，實(shí)際上也是生產(chǎn)規(guī)模的一次次的放大，在放大的過程中往往伴隨一些條件的變化，比如柱子直徑的變化，容器類型的變化，樣品放置時(shí)間的變化等等，這些變化會(huì)偶爾導(dǎo)致出現(xiàn)此前未出現(xiàn)的一些小概率事件，從而導(dǎo)致放大失敗甚至是生產(chǎn)失敗，以下列舉了一些小概率事件。
1、 二硫鍵還原
近年來，隨著高濃度哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，抗體鏈間二硫鍵還原現(xiàn)象變得更為常見，主要是受到硫氧還蛋白與硫氧還蛋白還原酶的影響。為了控制這種現(xiàn)象，下游有多種策略可供選擇，如保持收獲液通氣操作，降低細(xì)胞收獲液溫度，縮短細(xì)胞收獲液保存時(shí)間以及對(duì)深層過濾壓力進(jìn)行控制等，除此之外，有文獻(xiàn)提到加入過氧化氫來抑制還原現(xiàn)象的產(chǎn)生。更有意思的是，也有研究表明，即使在收獲期間抗體被還原，也可以在親和捕獲淋洗階段經(jīng)過氧化還原緩沖液的沖洗，被還原的抗體能夠重新氧化為完整抗體。在圖1中 Batch2保持收獲液空氣/氧氣的操作，Batch1收獲液沒有通入任何氣體，結(jié)果顯示，Batch1在親和收獲后完整抗體比例很低，雖然后續(xù)層析步驟有所提升，但依然純度不高；而Batch2在整個(gè)工藝過程中都能保持較高比例的完整抗體。圖2中可以看到在親和純化過程中加入Wash2 氧化還原緩沖液淋洗步驟，可以將5%完整比例的抗體直接提升至93%的比例。然后通過Wash3緩沖液的沖洗來替換掉Wash2氧化還原劑組分，也不會(huì)影響后續(xù)的洗脫液。
而本文作者認(rèn)為二硫鍵還原最大的痛點(diǎn)并不在于二硫鍵還原現(xiàn)象本身，因?yàn)楝F(xiàn)在已有許多措施能夠解決此類問題。而真正的痛點(diǎn)在于在某些項(xiàng)目中二硫鍵還原只發(fā)生在放大以及生產(chǎn)階段，甚至有些在生產(chǎn)階段只出現(xiàn)親和層析的第二個(gè)或后面幾個(gè)循環(huán)中，然而在小試開發(fā)階段并不會(huì)出現(xiàn)此現(xiàn)象，因此在確認(rèn)工藝中并不會(huì)有抑制二硫鍵還原的措施。而小試與生產(chǎn)的差異原因推測(cè)可能是由于小試階段樣品的儲(chǔ)存容器主要為開口瓶或開口袋子，其中的收獲液可以與空氣接觸，而往往在生產(chǎn)階段收獲液主要保存于封口的儲(chǔ)液袋中，處于無氧狀態(tài)中，所以導(dǎo)致只在生產(chǎn)階段出現(xiàn)二硫鍵還原現(xiàn)象，對(duì)此本公司也有徹底的解決辦法。
圖1
圖2
2、 陽離子洗脫峰雙峰現(xiàn)象
陽離子的洗脫峰偶爾會(huì)出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，這種現(xiàn)象并不是由于分辨高能夠分離兩種不同的組分，因?yàn)閷蓚€(gè)峰的任一峰組分重新上柱且保持同樣的純化條件，依然會(huì)再次出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象。將兩個(gè)峰進(jìn)行純度檢測(cè)，我們會(huì)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)峰純度是比較一致的。有文獻(xiàn)研究表明，雙峰現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能是填料結(jié)構(gòu)，沖洗或洗脫條件的差異所導(dǎo)致，也有研究表明，雙峰現(xiàn)象根本原因是蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生了改變。無論原因?yàn)楹?，雙峰現(xiàn)象都可以通過優(yōu)化填料種類，淋洗條件以及洗脫條件等得到解決。然而雙峰現(xiàn)象的真正的麻煩并不在于此現(xiàn)象本身，而是在有些案例中小尺寸的柱子洗脫峰并不能出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，而是會(huì)在更大尺寸或是生產(chǎn)規(guī)模的尺寸上才能展現(xiàn)出來，嚴(yán)重一些會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)收峰失敗從而導(dǎo)致當(dāng)批次生產(chǎn)失敗。圖3中比較了6款填料，其中Fractogel SO3，Eshmuno S，Nuvia S和POROS 50HS出現(xiàn)了明顯的雙峰，Source 30S和UNOsphere rapid S則不明顯。在圖4中可以看到鹽濃度不同，洗脫pH不同雙峰分布也不同，表明通過優(yōu)化洗脫條件也可以抑制雙峰現(xiàn)象。在圖5中可以看到柱直徑為1.1cm的時(shí)候出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象（0.5cm柱子上未出現(xiàn)，未展示），當(dāng)改變淋洗條件后雙峰消失，只剩唯一的洗脫峰。
圖3
圖4
圖5
3、 填料批次導(dǎo)致的收率大幅下降
在絕大多數(shù)的案例中填料批次往往并不是工藝關(guān)鍵參數(shù)，但是在極少數(shù)案例中，填料批次會(huì)極大影響工藝屬性表現(xiàn)。這就導(dǎo)致在小試階段工藝表現(xiàn)正常，而在放大或生產(chǎn)階段工藝表現(xiàn)異常。在表一中可以看到，Lot2的親和填料在兩個(gè)項(xiàng)目中的收率遠(yuǎn)低于其它批次（質(zhì)量無差異），所以批次的差異也需要在工藝開發(fā)中引起我們的注意。
表1 不同批次親和填料在不同項(xiàng)目中的表現(xiàn)
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Project
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Resin
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Elution
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Conc.
(g/L)
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Volume
(mL)
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Yield
(%)
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Project A
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Lot 1
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31.775
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7.507
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96.5
|
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Lot2
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15.783
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13.175
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82.7
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Lot 3
|
26.155
|
9.214
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96.4
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Lot4
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25.254
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9.42
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97.4
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Project B
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Lot 1
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36.058
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7.576
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89.3
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Lot2
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21.652
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10.548
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73.4
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Lot 3
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28.245
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9.658
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88.1
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Lot4
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29.584
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9.26
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90.6
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4、 總結(jié)
無論是二硫鍵還原、洗脫雙峰現(xiàn)象還是填批次導(dǎo)致的收率差異，往往發(fā)生于放大與生產(chǎn)過程中，不容易在小試階段被發(fā)現(xiàn)，同時(shí)這些都是小概率事件，很容易被工藝開發(fā)人員忽視。所以有必要在某些情況下建立相應(yīng)的工藝開發(fā)策略，以應(yīng)對(duì)這些小概率事件。
參考文獻(xiàn)
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京公網(wǎng)安備11010802046783號(hào)
