通過試驗設(shè)計（DOE）能夠科學(xué)高效地確定關(guān)鍵物料屬性（CMA）、關(guān)鍵工藝參數(shù)（CPP）對產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性（CQAs）的影響，有效解決產(chǎn)品的流程改進(jìn)與質(zhì)量控制問題，DOE已日益成為醫(yī)藥研發(fā)過程中的關(guān)鍵工具。
本文按照DOE基本流程，結(jié)合關(guān)于生物工程肝素制備的文獻(xiàn)[1]，解析醫(yī)藥研發(fā)DOE各階段實際操作過程中需要重點關(guān)注與考慮的一些問題。
1、計劃階段
在DOE的計劃階段首先應(yīng)該明確試驗擬解決的問題與目標(biāo)，進(jìn)而分析產(chǎn)品的CQAs以確定試驗研究的響應(yīng)指標(biāo)，并基于風(fēng)險分析確定可能顯著影響CQAs的潛在變量因子。同時關(guān)注試驗過程和測量系統(tǒng)的受控狀態(tài)，最終制定科學(xué)合理的試驗計劃。
文獻(xiàn)中作者認(rèn)為，保證生物工程肝素有效性的關(guān)鍵在于保證肝素產(chǎn)品的CQAs（分子量、N-乙?；潭龋┨幵谀繕?biāo)范圍內(nèi)，并且從商業(yè)化生產(chǎn)的角度來講，收率同樣關(guān)鍵，因此，確定了DOE的3個響應(yīng)指標(biāo)：分子量、N-乙?；潭取⑹章?。與上述3個響應(yīng)指標(biāo)密切相關(guān)的工藝步驟是肝素原去乙酰化處理環(huán)節(jié)，如圖1[1]所示：
圖1 肝素原去乙?；疽鈭D[1]
基于原理分析得出，肝素原起始濃度、NaOH濃度、反應(yīng)時間、溫度是最有可能影響上述3個響應(yīng)指標(biāo)的因子，因此，計劃首先通過2水平全因子試驗設(shè)計，篩選出對響應(yīng)指標(biāo)具有顯著影響的關(guān)鍵因子，之后通過Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計，獲得關(guān)鍵因子與響應(yīng)指標(biāo)的多元二次擬合方程，最后對擬合方程的有效性進(jìn)行驗證。
同時，試驗過程（例如反應(yīng)溫度、時間）與響應(yīng)指標(biāo)測量（例如分子量的測定）皆嚴(yán)格受控，能夠保證試驗體系的有效性。制定完善的試驗計劃之后，進(jìn)入關(guān)鍵因子的篩選階段。
2、篩選階段
在DOE的篩選階段，可根據(jù)歷史試驗數(shù)據(jù)、過程原理、風(fēng)險分析與經(jīng)驗來確定潛在因子，并對潛在的因子進(jìn)行篩選，確定對響應(yīng)指標(biāo)具有顯著影響的關(guān)鍵因子，用于下一階段的優(yōu)化或預(yù)測。文獻(xiàn)中對4個潛在因子進(jìn)行2水平全因子試驗，得出了多元一次擬合方程，如圖2[1]：
圖2 肝素原去乙?；囼炓蜃优c響應(yīng)值的多元一次擬合方程[1]
根據(jù)擬合方程系數(shù)的顯著水平，確定NaOH濃度、反應(yīng)時間、溫度對分子量、N-乙?；叹哂酗@著影響，并將在下一階段使用這3個關(guān)鍵因子進(jìn)行優(yōu)化或預(yù)測。
3、優(yōu)化或預(yù)測階段
在DOE的優(yōu)化或預(yù)測階段，通常通過中心復(fù)合設(shè)計（CCD）、Box-Behnken響應(yīng)曲面設(shè)計[2]，建立起關(guān)鍵因子與響應(yīng)指標(biāo)的多元二次擬合方程函數(shù)關(guān)系，可據(jù)此確定關(guān)鍵因子的最優(yōu)水平組合或者根據(jù)期望的響應(yīng)指標(biāo)值預(yù)測出所需的關(guān)鍵因子水平。
值得注意的是，文獻(xiàn)中肝素原起始濃度對3個響應(yīng)指標(biāo)的影響均不顯著，并且4種潛在因子對收率指標(biāo)的影響同樣均不顯著。那么在接下來的優(yōu)化或預(yù)測階段應(yīng)該如何處置？此外，在優(yōu)化或預(yù)測階段關(guān)鍵因子的設(shè)定水平是否需要進(jìn)一步調(diào)整？這往往是DOE實際應(yīng)用中面臨的關(guān)鍵問題。
首先，對于非關(guān)鍵因子設(shè)定水平，應(yīng)重點權(quán)衡是否對醫(yī)藥產(chǎn)品生產(chǎn)具有積極作用，例如經(jīng)濟(jì)性、高效性等。文獻(xiàn)中將肝素原起始濃度設(shè)定在研究范圍的最高水平，原因是高濃度有利于提高肝素原的批處理通量，能夠提高生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)性與效率。
其次，4種潛在因子對收率指標(biāo)的影響均不顯著，這意味著在所考察的因子水平范圍內(nèi)，收率的變異主要是由誤差引起，而非隨因子設(shè)定值改變發(fā)生顯著性變化，因此，在優(yōu)化或預(yù)測階段，若因子設(shè)定值范圍未發(fā)生改變，那么不再將收率作為優(yōu)化或預(yù)測的過程指標(biāo)。
第三，優(yōu)化或預(yù)測階段對關(guān)鍵因子設(shè)定水平進(jìn)行一定的調(diào)整往往是必要的。需要根據(jù)具體的過程目標(biāo)，將接近最優(yōu)響應(yīng)值的因子水平設(shè)定為中心點，這樣有利于保證擬合函數(shù)對最優(yōu)值預(yù)測能力[2]。此外，歷史試驗數(shù)據(jù)可作為因子水平范圍選擇的重要參考依據(jù)。
根據(jù)上述原則，文獻(xiàn)中作者通過Box-Behnken曲面響應(yīng)建立了關(guān)鍵因子與響應(yīng)指標(biāo)的多元二次擬合方程函數(shù)關(guān)系(圖3[1])，并繪制了曲面響應(yīng)圖（圖4[1]）。并在下一階段對曲面相應(yīng)函數(shù)關(guān)系進(jìn)行了有效性驗證。
圖3 肝素原去乙?；囼炓蜃优c響應(yīng)值的多元二次擬合方程[1]
圖4 肝素原N-乙?；潭葘A濃度、時間的響應(yīng)曲面[1]
4、驗證階段
驗證階段需要在預(yù)測的最優(yōu)條件下執(zhí)行試驗以確認(rèn)實際結(jié)果與預(yù)測所得優(yōu)化結(jié)果的相符性，以確定擬合函數(shù)用于優(yōu)化或預(yù)測的有效性。
文獻(xiàn)中作者使用不同分子量的起始肝素原進(jìn)行驗證，根據(jù)肝素原分子量與產(chǎn)品目標(biāo)分子量，計算出所需的 Depolymerization factor目標(biāo)響應(yīng)值，通過函數(shù)預(yù)測出達(dá)到期望目標(biāo)響應(yīng)值所需的試驗條件（關(guān)鍵因子水平），按照上述試驗條件執(zhí)行試驗，驗證實際所得肝素產(chǎn)品分子量與目標(biāo)產(chǎn)品分子量的接近程度。
此階段應(yīng)重點考慮擬合函數(shù)的預(yù)測能力，而預(yù)測能力主要會到受試驗誤差的影響，例如試驗條件的偶然性波動、響應(yīng)指標(biāo)測量誤差，導(dǎo)致擬合函數(shù)建立所依據(jù)的試驗信息可靠性變差[3]，從而降低了擬合函數(shù)的真實預(yù)測能力。由此可見，試驗過程中關(guān)鍵參數(shù)、響應(yīng)指標(biāo)測量系統(tǒng)的受控狀態(tài)對整個DOE的質(zhì)量至關(guān)重要，需要著重關(guān)注。在預(yù)測有效性得到保證的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步建立起過程目標(biāo)允許的范圍與關(guān)鍵因子水平所允許范圍之間的對應(yīng)關(guān)系，為進(jìn)一步建立設(shè)計空間（DSp）提供支持。
本文結(jié)合DOE基本流程架構(gòu)與案例文獻(xiàn)，條理性解析了醫(yī)藥研發(fā)DOE各階段實際操作過程中需要重點考慮與關(guān)注的關(guān)鍵問題，這將為DOE在醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的實際應(yīng)用提供重要的實用性參考。
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