抗體藥物研發(fā)、申報和生產(chǎn)過程均伴隨著對產(chǎn)品的質(zhì)量研究和質(zhì)量控制?？贵w藥物質(zhì)量分析涉及多個方面，歐洲藥品管理局（EMA）和國際協(xié)調(diào)會議（ICH）指南Q6B[1,2]都要求對抗體藥物進(jìn)行表征，從理化、結(jié)構(gòu)性質(zhì)和雜質(zhì)等方面進(jìn)行廣泛而全面的質(zhì)量屬性表征研究，為生物技術(shù)產(chǎn)品的表征提供了一套統(tǒng)一的國際公認(rèn)原則，以支持抗體藥物的市場應(yīng)用?？贵w藥物的結(jié)構(gòu)表征通常包括以下幾個方面，見表1。
表1 表征研究內(nèi)容
1. 一級結(jié)構(gòu)
1.1. 分子量
分子量分為完整分子量和還原分子量分子量，從整體來表征抗體分子，確認(rèn)抗體分子是否有片段缺失、錯配（圖1）。對于雙抗或其他多抗，目的分子和錯配分子（如同源二聚體）之間的分子量相差不大，小到相差十幾個Da，理化性質(zhì)差別小，用常規(guī)的色譜方法無法區(qū)分雙抗的錯配情況，需要用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）檢測出的精確分子量來檢測錯配比例，指導(dǎo)早期CMC工藝的開發(fā)。此外，還可以用特異的N/O糖酶（PNGase F和O-糖酶）切掉抗體上的N/O糖，消除糖型對分子量檢測的影響，從而可以更準(zhǔn)確的表征抗體分子特性。
圖1 雙抗樣本的分子量[3]
上：目的分子的完整分子量；下：錯配類型（LHL型）的分子量
1.2. 氨基酸序列覆蓋率與N/C端序列確認(rèn)
除了分子量，還需要用肽圖來表征目的分子的氨基酸序列。樣本經(jīng)變性還原和烷基化后，加特異性酶酶切，經(jīng)LC-MS檢測分析，與理論序列比對，得到抗體的序列覆蓋率。常用的酶有胰蛋白酶（trypsin）、Glu-C和糜蛋白酶（chymotrypsin）等，根據(jù)各酶的特異性酶切位點選擇合適的酶（表2）。結(jié)合多種酶切結(jié)果，可以達(dá)到100%的序列覆蓋率，確認(rèn)抗體氨基酸序列（圖2）[4]。N/C端序列可以結(jié)合氨基酸覆蓋率結(jié)構(gòu)來分析，確認(rèn)末端序列與目的序列一致。
表2 常用蛋白酶的酶切位點
圖2 抗體的肽圖
從上至下分別為胰蛋白酶、賴氨酸酶和天冬氨酸酶酶切的肽圖
2.翻譯后修飾
抗體分子在分泌、表達(dá)、純化和貯存過程中，受細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外環(huán)境的影響，會發(fā)生翻譯后修飾，常見的修飾有甲硫氨酸（Met）上的氧化（oxidation）、天冬酰胺（N）上的脫酰胺（deamidation）、N末端Q上的環(huán)化（pyroQ）和C末端丟失賴氨酸（K loss）等。這些修飾會引起抗體的局部構(gòu)象和電荷發(fā)生變化，在IEF上表現(xiàn)出不同比例的酸堿峰。發(fā)生在CDR的修飾會影響活性，引起抗體藥物治療效果的下降。分析翻譯后修飾和序列覆蓋率的樣本酶解方式相差不大，根據(jù)序列比對結(jié)果，計算翻譯后修飾的位點和比例。翻譯后修飾是酸堿峰表征和產(chǎn)品可比性研究中常見的檢測項目。以某項目為例，在三批次產(chǎn)品的可比性研究中，對翻譯后修飾進(jìn)行表征，結(jié)果顯示，三個批次產(chǎn)品和參比品之間的修飾類型和比例保持一致（表3）。值得注意的是，樣本在處理過程中可能也會引入修飾，造成假陽性修飾，此時，可以使用低pH酶解條件等來降低樣本處理引入的修飾。
表3 可比性研究中不同批次之間的翻譯后修飾比例
3.N糖
單抗在重鏈CH2的N297位有保守的N糖基化位點（保守序列為NX-S/T），多抗和重組蛋白通常有更多的N糖基化位點?？贵w在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中開始N糖基化，達(dá)到高爾基體（Golgi）后進(jìn)一步糖基化，最終生成復(fù)雜的N糖糖型?？贵w中常見的N糖糖型有G0、G0F、G1F、G2、G2F、Man5和Man8等。有研究顯示，在IgG1中， 沒有巖藻糖核心的糖（G0，G1等），會增強抗體與FcRIIa的結(jié)合，進(jìn)而提高ADCC活性，因此，針對此特點可以開發(fā)不同巖藻糖化水平的抗體，控制ADCC活性。當(dāng)高甘露糖（Man5，Man8等）比例高時，抗體在人體內(nèi)的清除變快，降低抗體的治療效果。
表征中確認(rèn)N糖基化位點時，樣本先用N糖苷酶PNGase F切掉N糖，糖基化位點的天冬酰胺殘基發(fā)生脫氨基化，造成0.9840 Da的質(zhì)量增加，經(jīng)過酶解和LC-MS/MS分析，尋找發(fā)生+0.9840Da的天冬酰胺，確認(rèn)N糖糖基化位點。
N糖糖型檢測時使用特異性的N糖苷酶PNGase F切掉N糖，因為N糖本身不能發(fā)熒光，需要用熒光試劑標(biāo)記N糖。常用的熒光標(biāo)記試劑有2-AB、2-AA、RapiFulor-MS和InstantPC等，市面上均有成熟的試劑盒，也可以自己配制使用。用HILIC分離熒光標(biāo)記的N糖，質(zhì)譜檢測分子量用于確定糖型，熒光檢測器檢測熒光強度用于定量，確定抗體的糖型和比例。圖3是一個IgG1類型抗體的N糖糖型熒光光譜[5]。
圖3 IgG1類型抗體的N糖糖型
4.高級結(jié)構(gòu)
4.1.二硫鍵確認(rèn)
抗體的不同鏈之間通過二硫鍵鏈接，鏈內(nèi)也有二硫鍵存在，以維持抗體的空間結(jié)構(gòu)和活性。通常IgG1類型單抗有16個二硫鍵，雙抗和多抗擁有更多的二硫鍵，重組蛋白的二硫鍵更錯綜復(fù)雜，鏈接形式也更加多樣。二硫鍵鏈接方式直接和抗體的活性有關(guān)，錯配會導(dǎo)致活性完全喪失，因此有必要利用質(zhì)譜技術(shù)來表征樣本的二硫鍵鏈接方式。樣本在非還原狀態(tài)下經(jīng)過特異性酶切，在LC-MS上檢測分析，利用串級數(shù)據(jù)，得到二硫鍵配對結(jié)果（圖4）[3]。
圖4 用LC MS/MS方法確認(rèn)抗體的鉸鏈區(qū)（A）及重鏈-輕鏈鏈間（B）二硫鍵
4.2. 圓二色性
抗體的高級結(jié)構(gòu)是由主鏈折疊產(chǎn)生，如α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角等，這些不對稱結(jié)構(gòu)使得抗體具有圓二色性。圓二色譜（Circular Dichroism，CD）法利用抗體的圓二色性和分子的不對稱性，根據(jù)左右偏振光吸收的不同來解析抗體的高級結(jié)構(gòu)。遠(yuǎn)紫外區(qū)(190-230mm)光譜可反映抗體的二級結(jié)構(gòu)，α螺旋、β折疊、轉(zhuǎn)角和不規(guī)則卷曲的比例。近紫外區(qū)(250-350mm)光譜反映抗體的三級結(jié)構(gòu)變化，側(cè)鏈生色基團(tuán)如色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸的排布信息和二硫鍵微環(huán)境的變化。
4.3. 熱穩(wěn)定性
通常用DSC（differential scanning calorimetry）來表征抗體的熱穩(wěn)定性，用Tm（溶解溫度）表示，Tm越高表示抗體分子越穩(wěn)定。圖5是生物類似藥與原研藥表征時Tm的比較[4]，兩者有類似的Tm1、Tm2和Tm3，說明類似藥與原研藥的高級結(jié)構(gòu)一致。
圖5 生物類似藥與原研藥的Tm值比較
5.生物學(xué)活性
抗體活性可以分為Fc相關(guān)的親和力活性和細(xì)胞活性，是抗體發(fā)揮腫瘤殺傷活性的的發(fā)生機制。親和力結(jié)合活性比如Fc片段與FcγRIa、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa、FcγRIIIb、FcRn和C1q的結(jié)合活性，依據(jù)抗體的MOA設(shè)計實驗?？贵w依賴的細(xì)胞毒性ADCC是抗體的Fc端與效應(yīng)細(xì)胞（主要是NK）表面的Fc受體（如FcγRIIIa/CD16）結(jié)合，介導(dǎo)效應(yīng)細(xì)胞殺傷腫瘤細(xì)胞。補體依賴的細(xì)胞毒性CDC是抗體Fc與補體系統(tǒng)的C1q結(jié)合，激活經(jīng)典補體通路，經(jīng)過一系列的信號放大，在靶細(xì)胞表面形成膜攻擊復(fù)合物，引起靶細(xì)胞裂解。常見的活性檢測方法有表面等離子共振和生物膜干涉等方法。
參考文獻(xiàn)
1.EMA. Guideline on Development, Production, Characterization and Specifications for Monoclonal Antibodies and Related Products (London, Dec. 2008).
2.ICH. Q6B Test Procedures and Acceptance Criteria for Biotechnological/Biological Products (1999).
3.Cao MY, et al. Characterization and Monitoring of a Novel Light-heavy-light Chain Mispair in a Therapeutic Bispecific Antibody. Journal of Pharmaceutical Sciences, 2021(110):2904-2915
4.Cho IH,et al. Evaluation of the structural, physicochemical, and biological characteristics of SB4, a biosimilar of etanercept. mAbs, 2016(8):1136-1155
5.Upton R,et al. Evaluating N-Glycosylation of a Therapeutic Monoclonal Antibody Using UHPLC-FLR-MS with RapiFluor-MS Labeling. Mass Spectrometry of Glycoproteins:189-203
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