細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
（征求意見稿）
一、概述
細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)又稱Ames試驗(yàn)，是一項(xiàng)檢測(cè)基因突變的體外致突變性試驗(yàn)，通過檢測(cè)受試物對(duì)微生物（細(xì)菌）的基因突變（注釋1）作用，預(yù)測(cè)其遺傳毒性和潛在的致癌作用。
細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)利用鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌來檢測(cè)點(diǎn)突變，涉及DNA的一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換、插入或缺失（注釋2）。鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌的試驗(yàn)菌株分別為組氨酸缺陷突變型和色氨酸缺陷突變型，在無組氨酸或色氨酸的培養(yǎng)基上不能生長，在有組氨酸或色氨酸的培養(yǎng)基上才能正常生長。致突變物存在時(shí)可以回復(fù)突變?yōu)樵B(yǎng)型，在無組氨酸或色氨酸的培養(yǎng)基上也可以生長。故可根據(jù)菌落形成數(shù)量來衡量受試物是否為致突變物。
某些致突變物需要代謝活化后才能使上述細(xì)菌產(chǎn)生回復(fù)突變，受試物要同時(shí)在有和沒有代謝活化系統(tǒng)的條件下進(jìn)行試驗(yàn)。
本指導(dǎo)原則依據(jù)《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》《化妝品注冊(cè)和備案檢驗(yàn)工作規(guī)范》《化妝品注冊(cè)備案資料管理規(guī)定》《化妝品新原料注冊(cè)備案資料管理規(guī)定》等相關(guān)要求，并參考國內(nèi)外相關(guān)指南制定。本指導(dǎo)原則適用于化妝品和化妝品新原料的研究及安全評(píng)估。
本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前科學(xué)認(rèn)知水平下制定的，隨著法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)的更新完善，以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將適時(shí)進(jìn)行調(diào)整。
二、基本原則
（一）試驗(yàn)管理
本指導(dǎo)原則所指的細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)屬于化妝品安全性評(píng)價(jià)的毒理學(xué)研究，應(yīng)在符合化妝品相關(guān)法規(guī)的前提下開展。
（二）具體問題具體分析
細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)的設(shè)計(jì)，應(yīng)基于化妝品或化妝品原料自身特點(diǎn)、性質(zhì)和使用情況，遵循“具體問題具體分析”的原則。根據(jù)受試物特點(diǎn)、現(xiàn)有數(shù)據(jù)、試驗(yàn)?zāi)康牡冗x擇合適的試驗(yàn)方法，設(shè)計(jì)適宜的試驗(yàn)方案，并結(jié)合其他毒理研究信息對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面的評(píng)價(jià)。
（三）隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)
遺傳毒性試驗(yàn)應(yīng)符合毒理學(xué)試驗(yàn)隨機(jī)、對(duì)照、重復(fù)的基本原則。
三、基本內(nèi)容
（一）菌株
細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)至少應(yīng)采用5種菌株，包括用于檢測(cè)組氨酸靶基因中鳥嘌呤-胞嘧啶（G-C）位點(diǎn)堿基置換或移碼突變的4種組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA98；TA100；TA1535；TA1537/TA97/ TA97a），以及用于檢測(cè)組氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位點(diǎn)堿基置換與檢測(cè)交聯(lián)劑的鼠傷寒沙門氏菌TA102或大腸桿菌WP2 uvrA或大腸桿菌WP2 uvrA（pKM101）。
新獲得的或者長期保存的菌種，在試驗(yàn)前需要進(jìn)行菌株的生物特性鑒定。鑒定的判斷標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)滿足《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》的要求。
（二）代謝活化系統(tǒng)
一些具有致突變的物質(zhì)需要代謝活化后才會(huì)引起細(xì)菌回復(fù)突變，因此細(xì)菌在加或不加代謝激活系統(tǒng)的情況下均應(yīng)暴露于受試物。
最常用的代謝活化系統(tǒng)是用多氯聯(lián)苯（PCB混合物）或用苯巴比妥和 β-萘黃酮組合處理的哺乳動(dòng)物（大鼠）肝臟微粒體酶（S9）。S9在S9混合液中的濃度一般為5%～30%（v/v）。代謝活化系統(tǒng)的選擇和條件取決于所測(cè)試化學(xué)物質(zhì)的類別。在某些情況下，可能需要使用兩種或兩種以上濃度的S9；對(duì)于偶氮染料和重氮化合物，更適合使用還原性代謝活化系統(tǒng)。
（三）受試物的處理
受試物應(yīng)采用工藝相對(duì)穩(wěn)定、純度和雜質(zhì)含量能反映上市樣品質(zhì)量和安全性的樣品。
在處理細(xì)菌之前，應(yīng)將固體受試物溶解或懸浮在適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉苊街?，并在必要時(shí)進(jìn)行稀釋。液體受試物可以直接添加到測(cè)試系統(tǒng)中和/或在處理之前進(jìn)行稀釋。
受試物應(yīng)新鮮配制，有資料表明其溶液或混懸液儲(chǔ)存穩(wěn)定者除外。
對(duì)于化妝品終產(chǎn)品，應(yīng)按照產(chǎn)品使用方法配制受試物，并明確配制方法和使用濃度。如為染發(fā)產(chǎn)品，應(yīng)按照產(chǎn)品使用方法或產(chǎn)品使用說明書中各劑型的配制比例進(jìn)行配制，如有多種配制比例，則需進(jìn)行多個(gè)比例受試物的配制。配制后的受試物如需進(jìn)一步稀釋，則應(yīng)選用合適的溶劑并設(shè)陰性對(duì)照。
對(duì)于化妝品新原料，應(yīng)根據(jù)原料的溶解性選擇適宜的溶劑進(jìn)行配制或稀釋，并設(shè)陰性對(duì)照。
（四）溶劑的選擇
所用溶劑應(yīng)不與受試物發(fā)生反應(yīng)，對(duì)試驗(yàn)菌株毒性低且無致突變性。首選滅菌蒸餾水/去離子水，對(duì)于不溶于水的受試物可選擇其他溶劑，常用的有二甲基亞砜（DMSO）、丙酮、95%乙醇。
（五）最高濃度的確定
細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)中受試物的最高濃度主要取決于受試物對(duì)細(xì)菌的毒性和溶解度。細(xì)菌自發(fā)回變數(shù)的減少，背景菌變得清晰或被處理的培養(yǎng)物細(xì)菌存活數(shù)減少都是毒性的標(biāo)志。
對(duì)原料而言，一般最高劑量組可為5mg/皿或5µL/皿。對(duì)產(chǎn)品而言，有殺菌作用的受試物，最高劑量可為最低抑菌濃度，無殺菌作用的受試物，最高劑量可為原液。受試物至少應(yīng)設(shè)四個(gè)劑量組。每個(gè)劑量均做三個(gè)平行平板。
用細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)檢測(cè)某些受試物時(shí)，在不溶解的濃度范圍內(nèi)也能檢測(cè)出劑量相關(guān)性的遺傳毒性。建議采用以下方法檢測(cè)相對(duì)不溶的受試物：
如果沉淀不干擾計(jì)數(shù)，應(yīng)對(duì)產(chǎn)生沉淀的濃度進(jìn)行計(jì)數(shù)，且最高濃度不超過5mg/皿或5µL/皿。當(dāng)未觀察到細(xì)菌毒性時(shí)，應(yīng)以產(chǎn)生沉淀的最低濃度作為計(jì)數(shù)的最高濃度；當(dāng)觀察到劑量相關(guān)的細(xì)菌毒性或誘變性時(shí)，應(yīng)按可能產(chǎn)生毒性時(shí)的要求來確定最高濃度。
對(duì)于初始實(shí)驗(yàn)，應(yīng)至少使用五種不同的可分析濃度的測(cè)試物質(zhì)，各測(cè)試點(diǎn)之間的間隔約為 。在研究劑量-反應(yīng)關(guān)系時(shí)，可以適當(dāng)縮小測(cè)試點(diǎn)之間間隔。
（六）對(duì)照組的設(shè)置
試驗(yàn)應(yīng)同時(shí)設(shè)陽性對(duì)照組、溶劑對(duì)照組和未處理（空白）對(duì)照組，包括加和不加S9兩種情況。
陽性對(duì)照物要根據(jù)采用的菌株進(jìn)行選擇，并選擇合適的劑量以保證每次試驗(yàn)的有效性。
一般選擇已知的陽性誘變劑，如《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中收錄的疊氮化鈉、2-氨基蒽、敵克松、苯并（a）芘等。
四、試驗(yàn)結(jié)果分析與評(píng)價(jià)
（一）數(shù)據(jù)處理
應(yīng)及時(shí)對(duì)受試物各劑量組、空白對(duì)照（自發(fā)回變）、溶劑對(duì)照以及陽性對(duì)照的每皿回變菌落數(shù)進(jìn)行記錄，并計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。
（二）結(jié)果評(píng)價(jià)
根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果，受試物經(jīng)5個(gè)試驗(yàn)菌株測(cè)定后，只要有一個(gè)試驗(yàn)菌株，無論在加S9或未加S9條件下，符合下列情形之一的可判定受試物在本試驗(yàn)系統(tǒng)中具有致突變陽性：
（1）受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)在任一劑量條件下是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上并有可重復(fù)性；
（2）受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)在任一劑量條件下是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上并有可重復(fù)性；
（3）受試物TA1535、TA1537、WP2uvrA的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的三倍或三倍以上并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系；
（4）受試物TA97、TA97a、TA98、TA100、TA102、WP2uvrA（pKM101）的回變菌落數(shù)是溶劑對(duì)照回變菌落數(shù)的二倍或二倍以上并呈劑量-反應(yīng)關(guān)系。
如果受試物經(jīng)五個(gè)試驗(yàn)菌株檢測(cè)后，無論加S9和未加S9均為陰性，則可判定該受試物為致突變陰性。
（三）結(jié)果分析與解釋
試驗(yàn)結(jié)果的生物學(xué)相關(guān)性為首要考慮因素，試驗(yàn)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義不應(yīng)作為評(píng)判陽性反應(yīng)的唯一因素。細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)出現(xiàn)陽性結(jié)果，應(yīng)考慮受試物的純度，以確定陽性結(jié)果是否污染物所致。氨基酸（組氨酸或色氨酸）污染可能導(dǎo)致菌落數(shù)的升高而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)陽性結(jié)果常出現(xiàn)在最低抑菌濃度和最高非抑菌濃度的范圍內(nèi)，因此當(dāng)試驗(yàn)中出現(xiàn)可疑陽性時(shí)，應(yīng)通過改變?cè)囼?yàn)條件（如調(diào)整受試物或S9濃度，改變培養(yǎng)條件等），對(duì)可疑陽性的受試物進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，確保試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和準(zhǔn)確性。
當(dāng)細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn)對(duì)某類受試物的潛在致突變性不敏感時(shí)，體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變?cè)囼?yàn)可作為很好的替代和補(bǔ)充。
五、參考文獻(xiàn)
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3.國家食品藥品監(jiān)督管理總局. 藥物遺傳毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則 [S]. 2018.
4.中華人民共和國國家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì). 食品安
全國家標(biāo)準(zhǔn) 細(xì)菌回復(fù)突變?cè)囼?yàn): GB 15193.4-2014[S]. 北京: 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2015.
六、注釋
基因突變：在化學(xué)致突變物作用下細(xì)胞DNA中堿基對(duì)的排列順序發(fā)生變化。
堿基置換突變：引起DNA鏈上一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的置換。
移碼突變：引起DNA鏈上增加或缺失一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)。
堿基置換：有轉(zhuǎn)換(transition)和顛換(transversion)兩種形式。轉(zhuǎn)換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘧啶所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘌呤所代替。顛換是DNA鏈上的一個(gè)嘧啶被另一嘌呤所替代，或一個(gè)嘌呤被另一嘧啶所代替。
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