由于單克隆抗體對靶點的特異性，其在自身免疫性疾病或癌癥中的重要性日益增加[1]。重大的技術(shù)進(jìn)步使得用于疾病治療的單抗的發(fā)現(xiàn)和發(fā)展更快、更有效，雙特異性抗體和偶聯(lián)抗體等單抗新劑型的開發(fā)，進(jìn)一步增加了該類藥物的研究熱度[2]。單抗溶液通常根據(jù)市場需求轉(zhuǎn)化為藥品，如何穩(wěn)定的儲存是保證抗體溶液轉(zhuǎn)化為有效和安全藥品的關(guān)鍵步驟。為降低開發(fā)和儲存成本，并提高治療效果[3]，學(xué)者們針對影響抗體儲存穩(wěn)定性的因素進(jìn)行了研究，包括抗體分子自身性質(zhì)、環(huán)境應(yīng)力和儲存方式等因素。其中儲存方式因素中的容器和儲存溫度均對抗體的質(zhì)量有重要影響，本文通過對比不同容器和冷凍儲存方式，希望為選擇高效、低成本、保證質(zhì)量穩(wěn)定的抗體原液儲存方法提供新思路。
1、容器
容器看似是生物制藥生產(chǎn)的一個次要方面，但因與抗體溶液直接接觸，故容器質(zhì)量等相關(guān)性質(zhì)是影響抗體藥物原液活性和免疫原性的重要因素。
中國藥典對容器有以下要求：直接接觸藥品的包裝材料和容器應(yīng)符合國務(wù)院藥品監(jiān)督管理部門的有關(guān)規(guī)定，均應(yīng)無毒、潔凈，與內(nèi)容藥品應(yīng)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，并不得影響內(nèi)容藥品的質(zhì)量。容器需要防止可能改變產(chǎn)品性能的不利外部因素的產(chǎn)生，包括濕度、光線、氧氣和溫度變化、生物污染、物理損壞和泄露。研究發(fā)現(xiàn)容器會影響抗體的穩(wěn)定性和安全性，即它們與抗體發(fā)生相互作用[4-6]。例如在儲存過程中，容器內(nèi)容物與抗體的相互作用會導(dǎo)致可提取物和可浸出物的產(chǎn)生，是導(dǎo)致安全損害的重要屬性[7]。因此需要謹(jǐn)慎選擇抗體藥物的儲存容器，主要從容器材質(zhì)、可浸出物和可提取物以及容器的滅菌方法方面進(jìn)行比較及選擇，以降低與藥物的免疫原性相關(guān)的風(fēng)險。
1.1 容器材質(zhì)
1.1.1 不銹鋼
在抗體藥物的生產(chǎn)和儲存過程中，容器可分為三類：不銹鋼、瓶子和袋子。不銹鋼是一種典型的接觸材料，被廣泛用于生物制品的制造、運(yùn)輸和儲存，其中含鎳不銹鋼是冷凍原料藥長期儲存的一種重要、節(jié)省成本的材料，其表面光滑、易于清洗、消毒和去污垢。常用的類型是奧氏體不銹鋼 316L，是不銹鋼 316 的低碳配方[8]。奧氏體 316 型很容易制成復(fù)雜的工藝機(jī)械，但具有易腐蝕和導(dǎo)致藥品被污染的缺點，6%鉬不銹鋼的耐腐蝕性能優(yōu)于奧氏體316 型。鎳-鉻-鉬化合物在酸性或者堿性環(huán)境中均有良好的耐腐蝕性。以哈氏合金（C276 或C22）為基礎(chǔ)的金屬容器具有耐腐蝕性，鐵含量低等優(yōu)點，因此有時會選擇以哈氏合金為基礎(chǔ)的金屬容器，從而可以減輕高鹽配方帶來的潛在腐蝕風(fēng)險，如長期暴露于低 pH 或某些離子（如氯化物）的腐蝕槽。
1.1.2 塑料容器
由于塑料具有化學(xué)惰性，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療。塑料容器是通過加熱、加壓、添加催化劑和增塑劑等工藝將重復(fù)單體單元有序聚合而得到的，它們的性質(zhì)和制造過程允許調(diào)節(jié)不同的功能，如靈活性、水分滲透、透明度、可折疊性與熱滅菌的兼容性[5]。常用的聚合物有：聚乙烯（Polyethylene，PE）、聚氯乙烯（Polyvinyl chloride，PVC）、聚丙烯（Polypropylene，PP）、聚酰胺（Polyamid，PA）、聚碳酸酯（Polycarbonate，PC）、低密度聚乙烯（Low DensityPoly-Ethylene，LDPE）、高密度聚乙烯(High Density Polyethylene，HDPE)、共聚酯（Poly(ethylene terephthalateco-1,4-cylclohexylenedimethylene terephthalate)，PETG）和乙烯-醋酸乙烯共聚物（Ethylene-vinyl acetate copolymer，EVA）。PVC 是第一種用于制造可折疊容器的聚合物，除可濕陷性和透明度外，在其他的性能測試中表現(xiàn)很差。一般在聚合材料中使用添加劑，以滿足實際需求，其中增塑劑鄰苯二甲酸二辛酯（Di-(2-ethylhexyl Phthalate ，DEHP)的存在限制了儲存在 PVC 中的液體類型，因為增塑劑會浸出到所含藥品中。考慮到 DEHP 的長期安全性，一些國家已經(jīng)禁止使用 PVC 材料，用 EVA 和 PP 取代 PVC 以避免增塑劑的不必要遷移，具體聚合物的性能比較見表 1。
1.1.3 一次性容器
用于生物制藥的一次性塑料生物容器的使用率在逐漸增加。EVA 薄膜的開發(fā)改善塑料的相容性和透濕性等特性。EVA 是一種隨機(jī)共聚物，其性能取決于醋酸乙烯（VA）含量和分子量。VA 含量為 3%~12%的 EVA 的設(shè)計靈活性與塑化 PVC 相似。聚烯烴可以在不使用增塑劑的情況下進(jìn)行調(diào)整，但可能需要其他性能的添加劑。雖然 EVA 不含增塑劑，但和 PVC一樣，它的防潮性能較差，而且這種單層袋都需要二次包裝。多層膜的研制解決了水分的滲透問題。乙烯-乙烯醇共聚物（EVOH）具有高的氣體屏障，被用作核心，作為兩層 EVA 之間物理連接[9]。與非一次性塑料容器相比，一次性容器具有多個優(yōu)勢，包括增加工藝靈活性和便利性、減少滯留體積、降低清潔驗證成本以及降低交叉污染風(fēng)險[10-11]。容器壁的橫截面通常由幾個不同的共擠層組成，包括流體接觸層，氣體阻擋層，膠粘層和提供機(jī)械強(qiáng)度和保護(hù)的外層。雖然流體接觸層可以由惰性材料構(gòu)成，但是來自其他層的浸出物可能遷移到儲存溶液中。一次性容器的疏水性導(dǎo)致可浸出物會吸附在液-固界面，從而會影響抗體質(zhì)量。尤其是在溶液中蛋白質(zhì)的聚集和顆粒的形成，這可能會導(dǎo)致對免疫原性的額外關(guān)注[12]。
目前市場上主要的一次性袋子有：
（1）RoSS 外殼用于保護(hù)一次性生物容器，保護(hù)藥品并實現(xiàn)快速凍融，以便后續(xù)運(yùn)輸和處理。
（2）Flexsafe 袋子，采用高性能聚乙烯膜制作，S80 薄膜的厚度、強(qiáng)度和韌性提高袋子的機(jī)械強(qiáng)度，F(xiàn)lexsafe 的強(qiáng)度降低因操作不當(dāng)導(dǎo)致袋子意外破損的風(fēng)險，并且 γ 輻照后無老化效應(yīng)。
（3）Celsius® FFT 和 Celsius® FFTp 容器，以 LLDPE 和EVOH 為骨架，以 LLDPE 為接觸層，較高的韌性可以安全方便的冷凍和解凍。具體見圖 1。
1.2 容器相關(guān)的可浸出物和可提取物
塑料是可提取物和可浸出物的最大來源。在使用這些塑料時，存在 3 個常見問題：
（1）滲透，即蒸汽和其他分子在容器壁的任意方向的滲透；
（2）浸出，即塑料成分浸出到產(chǎn)品；
（3）吸附，即塑料材料上的藥物分子或離子吸附。
滲透是最廣泛的問題之一，通過允許揮發(fā)性成分、水或特定的藥物分子遷移通過容器壁，從而導(dǎo)致容器內(nèi)容物的損失。當(dāng)塑料配方中的某些成分遷移到產(chǎn)品中，如增塑劑或抗氧化劑，浸出可能是一個問題。浸出物質(zhì)的特性及其積累水平可能會影響儲存在容器中的產(chǎn)品的最終效用[13]。因此，塑料聚合物配方應(yīng)有較少的添加劑。吸附是一個選擇性問題，即少量藥物分子的吸附發(fā)生在特定的聚合物上。已有研究表明，單克隆抗體可以吸附塑料等材料[14-15]。水分流失：儲存過程中水分的流失反向滲透也可能發(fā)生，塑料材料具有較高的透氣性，氧氣或其他分子滲透到容器內(nèi)部，導(dǎo)致易感成分氧化或降解。對不銹鋼來說，重點考慮金屬離子的影響。金屬離子可以從藥品或與設(shè)備接觸的產(chǎn)品中濾出，一些塑料包裝、玻璃瓶、橡膠塞子也可能是金屬滲透液的來源。緩沖液種類、每單位不銹鋼接觸表面積的測試介質(zhì)填充量、配方輔料如金屬螯合劑類型和濃度、pH 儲存溫度和不銹鋼接觸時間等因素對金屬離子濃度有重要影響。
1.3 容器的滅菌方法
容器材料和添加劑在 γ 輻照殺菌過程中的降解是可浸出物的另一個重要來源[16]，須關(guān)注滅菌方法對容器性能的影響，方法有蒸汽滅菌、熱力滅菌、γ 輻照、氣相滅菌法、紫外線照射法。蒸汽滅菌是減少蛋白質(zhì)氧化的最佳方法，但許多材料在熱力滅菌條件下會軟化或熔化，因此必須對環(huán)氧乙烷或其降解產(chǎn)物的殘留物及其潛在的毒性作用進(jìn)行仔細(xì)的評估。γ 輻照會對塑料的外觀和產(chǎn)品的穩(wěn)定性產(chǎn)生負(fù)面影響，一些 PP 配方經(jīng)輻照后會發(fā)生降解[1]，PVC經(jīng)輻照會導(dǎo)致顏色從透明到黃色的變化，pH 值變化和可萃取物的增加。具體聚合物的性能比較見表 2。
上述分別講述了容器的材質(zhì)、可浸出物和可提取物、容器的滅菌方法對抗體藥物的穩(wěn)定性的影響，可以看出不銹鋼具有耐用、容量大等優(yōu)點，但較重，不易操作，且耐酸堿腐蝕性較瓶子或一次性袋子較差，同時會有金屬離子的浸出；瓶子是使用較多的一種藥物容器，具有成本低、可靠的優(yōu)點，但添加劑帶來的可進(jìn)出和可提取物較多；一次性袋子是較新的藥物容器，具有高靈活性，同時具有較少的可浸出物和可提取物，耐酸堿性比較好，重量輕，易于操作和挪動，但成本相對瓶子來說比較高。具體的容器的比較見表 3。
2、低溫儲存
儲存過程中的溫度對抗體藥物的質(zhì)量有著至關(guān)重要的影響。對降解途徑的研究表明，抗體在低溫下降解較慢，因此低溫儲存是延長貨架期的一個很好的選擇[18]，同時降低生產(chǎn)過程中的投入資本。低溫儲存包括兩個步驟：一是冷凍，抗體藥物在零下溫度下轉(zhuǎn)變?yōu)楣虘B(tài)；二是解凍，抗體藥物在儲存過程結(jié)束時回到室溫。在實際應(yīng)用過程中主要通過不受控速率冷凍和受控速率冷凍兩種方式實現(xiàn)抗體藥物的低溫儲存。
2.1 低溫儲存的方式
低溫儲存的方式有不受控速率和受控速率方式。不受速率的冷凍是將含有抗體藥物的容器放入溫度控制單元中，直到物料達(dá)到設(shè)定溫度值。最簡單、直接的方式是將適當(dāng)大小的瓶子儲存在冰箱中，這種瓶子通常由聚丙烯或聚乙烯制成。控制速率冷凍是一種越來越常用的冷凍方法，此種方法是將藥物容器被放置在一致的傳熱去除條件下。冷凍方式被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)降解的潛在因素[19-20]。冷凍過慢會導(dǎo)致低溫濃縮效應(yīng)加劇，蛋白和賦形劑在冰晶形成的前沿附近產(chǎn)生濃度梯度，并被排除在冰-液界面之外。這會導(dǎo)致組分之間出現(xiàn)pH 值變化和相分離，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)損壞。在冷凍過程中，冰晶形成時移動的冰峰會排除溶質(zhì)分子，可能會發(fā)生蛋白質(zhì)溶液的低溫濃縮，導(dǎo)致蛋白質(zhì)集中在濃度較高的區(qū)域[21-23]。解凍是冷凍的盛有藥物的容器被放置在環(huán)境條件下（冰箱或室溫）直到完全液化，在沒有主動控制的情況下，解凍時間取決于容器大小，若沒有搖動或攪拌，每個容器都會存在顯著的濃度和溫度梯度。主動控制系統(tǒng)目前僅限于不銹鋼、合金和 EVA 多層袋。
受控速率系統(tǒng)：
（1）Cryo Fin-Cryovessel 可控凍融系統(tǒng)，CryoFin 由冷凍罐，熱控制單元和攪拌器組成。規(guī)格包括 20、60、125、200、300 L。由不銹鋼及其合金材質(zhì)組成所以比較耐用。凍融過程重現(xiàn)性比較好，保證密封性。
（2）RoSS pFTU 板式凍融系統(tǒng)，分為實驗室級、小規(guī)模、大規(guī)模和超大規(guī)模。RoSS pFTU 超大規(guī)模凍融系統(tǒng)將取代 CryoVessel 不銹鋼凍融系統(tǒng)，不同于一次性工藝，后者現(xiàn)用于超大體積的生產(chǎn)。
（3）東富龍立式堆疊凍融系統(tǒng)，自定義設(shè)置冷凍和解凍工藝。
（4）Celsius® FFTp-臥式凍融系統(tǒng)：容器組裝完整，適用于臥式平板凍融器。專為臥式平板凍融器而設(shè)計。板子均是透明便于查看和檢查袋室。不受控速率系統(tǒng)的優(yōu)勢主要是操作簡單方便，主要有普通冰柜和冰箱。
主要外觀見圖 2。
2.2 低溫儲存的影響因素
盡管低溫儲存可以延長貨架期，但如何實現(xiàn)低溫方面需要考慮一些問題。
（1）容量。不受控系統(tǒng)受儲存和各種處理因素的限制，目前表明最大容量為 20 L/瓶。受控系統(tǒng)從 2.1 L（最小袋容量）到 300 L（不銹鋼罐）不等。
（2）儲存溫度。不受控系統(tǒng)可加工至－70 ℃或－80 ℃并儲存，可用的冰柜可容納大多數(shù)尺寸。對于塑料為基礎(chǔ)的容器，在處理時必須充分考慮在這種溫度下的脆性。受控系統(tǒng)可以在－50 ℃進(jìn)行加工，而不銹鋼系統(tǒng)的操作儲存可能也僅限于相同的溫度。一次性袋子可以儲存在－70 ℃或－80 ℃，由于可能易碎，有一些處理問題。
（3）成本。在－20 ℃以下的儲存，由于涉及的尺寸和體積，任何類型的系統(tǒng)都需要特定的設(shè)施?？紤]容器是一次性還是可重復(fù)使用的，當(dāng)使用一次性容器時，必須解決其成本和處置問題。
（4）容器。容器的設(shè)計直接影響其清潔度，容器應(yīng)完全排水，避免尖角和積水區(qū)域。受控速率系統(tǒng)可能需要多個容器來儲存一批溶液，因此涉及多個容器關(guān)閉，這意味著會增加污染的風(fēng)險。由于沉積物的負(fù)載或腐蝕物的集中促進(jìn)金屬的點蝕，因此使用不銹鋼或瓶子容器需要大量的維護(hù)、驗證和清潔程序。一次性袋子在這方面是有利的，但必須考慮處理和廢物管理的成本。一次性袋子在經(jīng)濟(jì)、方便和質(zhì)量方面超過傳統(tǒng)的不銹鋼和瓶子，由于產(chǎn)品交叉污染的風(fēng)險以及清潔驗證的成本，這些因素共同促使制造商遠(yuǎn)離固定設(shè)備，轉(zhuǎn)而擁抱一次性技術(shù)。
不受控系統(tǒng)的優(yōu)點是簡單、重量輕、節(jié)省成本，缺點是包括缺乏主動過程的控制和容器之間的潛在變異性，室溫下將多個容器裝載到冰箱容易超過其冷卻能力。雖然對于不受控速率的凍融，總有一些控制措施，如溫度設(shè)定點，但還有其他幾個因素可以影響凍融過程和達(dá)到設(shè)定點溫度所需的時間，包括傳熱速率、流體流道長度、空氣流速、冷凍器容量和解凍步驟的攪拌，這些不受控制的凍結(jié)和解凍速度的因素會隨著運(yùn)行的不同而不同。如果配方中的蛋白質(zhì)在廣泛的凍融條件下穩(wěn)健且穩(wěn)定，并且可以承受低溫濃縮，這是許多公司首先選擇的運(yùn)營模式。受控速率系統(tǒng)，可以使冷凍和解凍的抗體藥物濃度更加均一，使蛋白質(zhì)更穩(wěn)定，有穩(wěn)定的性能可擴(kuò)展與可重復(fù)性的熱分布方面，相比非控制速率系統(tǒng)，減少時間成本，但由于需要特殊設(shè)備，所以成本相對較高，并且受到特定設(shè)備的可用性和集裝箱的尺寸限制，它的容量可能受到限制[24]，為保證抗體藥物質(zhì)量的穩(wěn)定性，較多公司會選擇控制速率系統(tǒng)。不同儲存系統(tǒng)的比較見表 4。
3、結(jié) 語
研究表明，抗體溶液在固體和液體狀態(tài)下保持的時間越長，聚集的機(jī)會或傾向其他降解途徑的機(jī)會就越大，會導(dǎo)致抗體藥物的穩(wěn)定性受到影響。在影響抗體穩(wěn)定性因素中儲存容器和儲存系統(tǒng)的變化是重要影響因素之一，因此選擇一個合理的儲存方式，對蛋白質(zhì)的質(zhì)量穩(wěn)定是至關(guān)重要的，上面列出了儲存容器和儲存方式的優(yōu)缺點，為抗體藥物更穩(wěn)定地儲存提供理論支持。
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