皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則
（征求意見稿）
一、概述
皮膚變態(tài)反應(yīng)（skin sensitization ，allergic contact dermatitis）是皮膚對一種物質(zhì)產(chǎn)生的免疫原性皮膚反應(yīng)。在人類這種反應(yīng)可能以瘙癢、紅斑、丘疹、水皰、融合水皰為特征。動物的反應(yīng)不同，可能以皮膚紅斑和水腫為特征。
皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)旨在確定重復(fù)接觸化妝品原料或產(chǎn)品對哺乳動物是否可引起變態(tài)反應(yīng)及其程度。為化妝品原料或產(chǎn)品安全性毒理學(xué)試驗(yàn)的重要組成部分。
本指導(dǎo)原則根據(jù)《化妝品注冊備案管理辦法》、《化妝品注冊備案資料管理規(guī)定》、《化妝品新原料注冊備案資料管理規(guī)定》、《化妝品注冊和備案檢驗(yàn)工作規(guī)范》等要求制定，適用于化妝品和新原料的研究及安全評估。本指導(dǎo)原則是在現(xiàn)行法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)以及當(dāng)前科學(xué)認(rèn)知水平下制定的，隨著科學(xué)研究的進(jìn)展，本指導(dǎo)原則中的相關(guān)內(nèi)容將不斷完善與更新。
二、基本原則
皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)應(yīng)在遵循安全性評價普遍規(guī)律的基礎(chǔ)上，結(jié)合受試物的特點(diǎn)，進(jìn)行規(guī)范性試驗(yàn)，對試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行全面分析評價。
試驗(yàn)設(shè)計應(yīng)符合毒理學(xué)試驗(yàn)隨機(jī)、對照、重復(fù)的基本原則，試驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)真實(shí)、完整、準(zhǔn)確、可追溯。
本指導(dǎo)原則僅闡述皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)需要重點(diǎn)關(guān)注的問題，試驗(yàn)時需具體情況具體分析。
三、基本內(nèi)容
（一）實(shí)驗(yàn)動物的選擇、管理
一般選用健康、成年雄性或雌性豚鼠，雌性動物應(yīng)未孕或未曾產(chǎn)仔。實(shí)驗(yàn)動物環(huán)境應(yīng)與動物等級相匹配并符合國家相應(yīng)規(guī)定。實(shí)驗(yàn)動物飼料應(yīng)選用標(biāo)準(zhǔn)配合飼料，需注意補(bǔ)充適量維生素C。
（二）實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量
局部封閉涂皮試驗(yàn):試驗(yàn)組至少20只，對照組至少10只。豚鼠最大值試驗(yàn)：試驗(yàn)組至少10只，對照組至少5只。如果試驗(yàn)結(jié)果難以確定受試物的致敏性，應(yīng)增加動物數(shù)，試驗(yàn)組至少20只，對照組至少10只。
（三）受試物的配制
對于化妝品終產(chǎn)品，可選擇原樣或按照產(chǎn)品使用方法配制受試物，并明確配制方法和使用濃度。當(dāng)一種產(chǎn)品含有兩個或兩個以上部分，分別和/或混合檢驗(yàn)的樣品，應(yīng)根據(jù)實(shí)際檢驗(yàn)部分列出所有受試物和對應(yīng)部分,并設(shè)陰性對照。
對于化妝品新原料，根據(jù)原料特性，選擇原物或根據(jù)原料的溶解性選擇適宜的溶劑進(jìn)行配制或稀釋，并設(shè)陰性對照。
（四）受試物劑量的設(shè)計
在正式試驗(yàn)前需進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，誘導(dǎo)接觸受試物濃度為能引起皮膚輕度刺激反應(yīng)的最高濃度，激發(fā)接觸受試物濃度為不能引起皮膚刺激反應(yīng)的最高濃度。
（五）對照組的設(shè)置
試驗(yàn)時應(yīng)同時設(shè)置陽性對照、陰性對照。
1.陽性對照組：
在實(shí)驗(yàn)室開展變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)初期，或使用新的動物種屬或品系時，需同時設(shè)陽性對照組。使用已知的能引起輕度/中度致敏的陽性物每隔半年檢查一次。激發(fā)接觸后24h、48h，局部封閉涂皮法均至少有30%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應(yīng)；皮內(nèi)注射法均至少有60%動物出現(xiàn)皮膚過敏反應(yīng)。
2.陰性對照組：
在誘導(dǎo)接觸時僅涂以溶劑作為對照，在激發(fā)接觸時涂以受試物。對照組動物和受試物組動物必須為同一批。
（六）誘導(dǎo)接觸和激發(fā)接觸
1. 局部封閉涂皮試驗(yàn)（Buehler Test, BT）
取受試物樣品約0.2 mL（g）于0d、7d、14d誘導(dǎo)三次。末次誘導(dǎo)后14-28d激發(fā)。對照組同法操作。
2. 豚鼠最大值試驗(yàn) (Guinea Pig Maximinatim Test , GPMT)
采用皮內(nèi)注射0.1 mL相應(yīng)的溶液進(jìn)行第一次誘導(dǎo)。第一次誘導(dǎo)后的第7d，用涂有0.5g(mL)受試物的濾紙敷貼，進(jìn)行第二次誘導(dǎo)。對無皮膚刺激作用的受試物，可加強(qiáng)致敏。對照組僅用溶劑作誘導(dǎo)處理。誘導(dǎo)接觸后第21d，用涂有0.5g(mL)受試物的濾紙片激發(fā)。對照組同法操作。
四、結(jié)果評價
按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)皮膚反應(yīng)積分表進(jìn)行評分，并按照致敏強(qiáng)度分級表判定致敏強(qiáng)度。
(一) 局部封閉涂皮試驗(yàn)（Buehler Test, BT），激發(fā)接觸后24h和48h觀察皮膚反應(yīng)。皮膚反應(yīng)主要分為紅斑和焦痂形成，以及水腫形成兩種表現(xiàn)。當(dāng)皮膚涂敷部位出現(xiàn)嚴(yán)重紅斑（紫紅色）至輕微焦痂形成，記4分；當(dāng)出現(xiàn)中度至重度紅斑或重度水腫（皮膚隆起約1 mm或超過1 mm）時，均分別記3分；當(dāng)出現(xiàn)明顯紅斑或輕度水腫（皮膚隆起輪廓清楚）時，均分別記2分；當(dāng)出現(xiàn)輕微紅斑或輕微水腫時，均分別記1分。當(dāng)受試物組動物出現(xiàn)皮膚反應(yīng)積分≥2時，可判定該動物出現(xiàn)皮膚變態(tài)反應(yīng)陽性。如結(jié)果可疑，于第一次激發(fā)后一周重新激發(fā)，對照組操作步驟同受試物組或按豚鼠最大值試驗(yàn) (Guinea Pig Maximinatim Test , GPMT) 的方法進(jìn)行評價。
（二）豚鼠最大值試驗(yàn) (Guinea Pig Maximinatim Test , GPMT)，激發(fā)接觸結(jié)束，除去涂有受試物的濾紙后24、48和72h，觀察皮膚反應(yīng)。當(dāng)皮膚出現(xiàn)重度紅斑和水腫時，記3分；當(dāng)出現(xiàn)重度紅斑和融合紅斑時，記2分；當(dāng)出現(xiàn)散在或小塊紅斑時，記1分。當(dāng)受試物組動物皮膚反應(yīng)積分≥1時，可判定變態(tài)反應(yīng)陽性。如結(jié)果可疑，于第一次激發(fā)后一周，給予第二次激發(fā)，對照組操作步驟同受試物組。
按照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中致敏強(qiáng)度表進(jìn)行受試物致敏強(qiáng)度分級，當(dāng)致敏率為0時，可判為未見皮膚變態(tài)反應(yīng)。
五、參考文獻(xiàn)
1. 國家藥品監(jiān)督管理局.化妝品安全技術(shù)規(guī)范.2015.
2. OECD. Guideline for the testing of chemicals No.406: Skin Sensitization. 2022.
3. 中華人民共和國衛(wèi)生部. 中華人民共和國國家職業(yè)衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn) 化學(xué)品毒理學(xué)評價程序和試驗(yàn)方法 第7部分：皮膚致敏試驗(yàn): GBZ/T 240.7-2011.
六、術(shù)語和釋義
1.誘導(dǎo)接觸（induction exposure）:指機(jī)體通過接觸受試物而誘導(dǎo)出過敏狀態(tài)的試驗(yàn)性暴露。
2. 誘導(dǎo)階段（induction period）：指機(jī)體通過接觸受試物而誘導(dǎo)出過敏狀態(tài)所需的時間，一般至少一周。
3. 激發(fā)接觸（challenge exposure）：機(jī)體接受誘導(dǎo)暴露后，再次接觸受試物的試驗(yàn)性暴露，以確定皮膚是否會出現(xiàn)過敏反應(yīng)。
七、附錄
試驗(yàn)方法可參照《化妝品安全技術(shù)規(guī)范》中收錄的“皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)”。
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