近期，香港理工大學(xué)鄭子劍、趙昕教授和華東理工大學(xué)劉昌勝院士團隊在科愛創(chuàng)辦的期刊Bioactive Materials上發(fā)表了一篇以《人工纖毛用于BMP-2在生物材料表面的共價固定》為題的文章。文章報道了一種共價固定策略，在材料表面原位生長出聚合物刷后將其與骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2（BMP-2）化學(xué)鍵合，成功構(gòu)建了高活性骨修復(fù)材料，該材料在顱骨臨界尺寸缺損動物實驗中展示了比物理吸附BMP-2組表現(xiàn)出更好的成骨效果。這種策略可以應(yīng)用于局部控制生物大分子偶聯(lián)，為各種組織的加速再生提供了新方案。
目前，原位固定并保持生長因子的生物活性（如骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2）仍然是一個巨大的挑戰(zhàn)，作者采用了一種柔軟而穩(wěn)定的表面改性策略來解決此問題。作者將BMP-2共價固定在均質(zhì)聚甲基丙烯酸甘油酸酯(PGMA)聚合物刷上，該聚合物刷通過表面引發(fā)原子轉(zhuǎn)移自由基聚合反應(yīng)（SI-ATRP）接枝到了基材(金片、石英玻璃、二氧化硅晶片等)表面。這種表面修飾方法不僅增加了功能化界面面積，還具有簡單、快速、溫和的特點；共價固定化后的BMP-2構(gòu)象和二級結(jié)構(gòu)均保存良好。此外，在均質(zhì)PGMA聚合物刷表面固定的BMP-2 (i-BMP-2)表現(xiàn)出了優(yōu)異的生物活性(與對照組體外游離BMP-2相比，生物活性保持在其87%左右，比體內(nèi)游離BMP-2支架的生物活性高20%-50%)。PGMA聚合物刷可修飾不同組織工程支架的表面，促進生長因子的原位固定，提高材料表面的生物活性，加速多種類型組織的修復(fù)。
一、PGMA聚合物刷的制備及BMP-2的固載
首先在金片表面引入SI-ATRP引發(fā)劑，引發(fā)GMA單體在金片表面“生長”成大分子刷狀結(jié)構(gòu)。之后利用PGMA刷上的環(huán)氧基團與BMP-2的氨基發(fā)生的開環(huán)反應(yīng)，將BMP-2共價耦合到材料表面（圖1a）。AFM圖像（圖1 b-d）顯示，經(jīng)過PGMA表面改性的金片表面粗糙度出現(xiàn)明顯增加，BMP-2固定化后粗糙度略有提高。拉曼光譜（圖1e）和XPS（圖1f）結(jié)果表明，BMP-2的固定改變了PGMA表面的化學(xué)成分,說明BMP-2在PGMA聚合物刷上成功耦合。
圖1 BMP-2在PGMA表面的固定及PGMA和PGMA-BMP-2的表征
二、PGMA-BMP-2的生物相容性研究
作者將PGMA聚合物刷以及PGMA改性并固載BMP-2的不同基材與小鼠成肌細胞C2C12共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)各基材表面的PGMA聚合物層均具有良好的生物相容性。熒光染色（圖2c）圖像表明PGMA聚合物刷有利于細胞黏附和擴展，同時還表明固定化的BMP-2有抑制C2C12的增殖而促進其向成骨細胞分化的趨勢。
圖2 PGMA聚合物刷層的生物相容性
三、固定化BMP-2的成骨活性研究
通過C2C12細胞共培養(yǎng)ALP染色研究PGMA聚合物刷上固定的BMP-2（i-BMP-2）的成骨活性。通過定量ALP活性測定和定性ALP染色實驗（圖3 a-b），作者發(fā)現(xiàn)i-BMP-2培養(yǎng)的C2C12在溶液中的ALP活性高達游離BMP-2培養(yǎng)的C2C12的ALP活性的87%，這說明PGMA聚合物刷上的BMP-2保持了相當(dāng)高的成骨生物活性。作者還發(fā)現(xiàn)，PGMA-BMP-2在用細胞裂解液或酒精浸泡處理后仍可保持BMP-2的生物活性（圖3c-d），固定在不同底物上的BMP-2培養(yǎng)的C2C12的ALP活性在82%至88%之間（圖3e）。最后的圓二色譜結(jié)果也證實了i-BMP-2的二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變，說明PGMA聚合物刷可有效保持BMP-2的成骨生物活性。
圖3 固定化BMP-2（i-BMP-2）的成骨活性
四、PGMA聚合物刷固載BMP-2促進體內(nèi)成骨
隨后，作者又利用大鼠顱骨臨界缺損修復(fù)實驗驗證PGMA聚合物固載BMP-2的體內(nèi)成骨效果，Micro-CT（圖4a）及定量結(jié)果（圖4 b-c）顯示，PGMA聚合物刷更有利于成骨相關(guān)細胞在體內(nèi)的粘附，加速相關(guān)的成骨過程，且其固定的BMP-2不僅在體內(nèi)保持了良好的生物活性，還表現(xiàn)出更好的成骨效果和更長的效果持續(xù)時間。組織切片結(jié)果（圖5）和免疫組織化學(xué)分析結(jié)果均表明，使用PGMA聚合物刷固載的BMP-2在體內(nèi)具有更好的成骨效果。
圖4 PGMA聚合物刷固載BMP-2的體內(nèi)促成骨效果
圖5 Masson三色染色法對6周和12周骨再生切片組織學(xué)評價。(NB:新骨;CB:松質(zhì)骨;F:纖維組織;M:材料;BM:骨髓;CC:軟骨)
上述體外實驗結(jié)果表明，PGMA聚合物刷固定的i-BMP-2能夠維持BMP-2的生物活性。與溶液中的BMP-2一樣，i-BMP-2可以迅速與細胞表面的特異性BMP-2受體（BMP-R）結(jié)合，激活下游Smad信號通路，增強成骨相關(guān)基因的表達，促進成骨（圖6）。
圖6 PGMA固定化BMP-2 (i-BMP-2)和游離BMP-2在成骨細胞分化中的作用機制
綜上所述，文章作者成功開發(fā)了一種用于原位固定BMP-2的PGMA聚合物刷表面改性層，該改性層可用于多種材料（金片、石英玻璃、3D打印多孔支架等）的表面修飾，并在高效固載BMP-2的同時維持BMP-2的促成骨活性。該項目為提高傳統(tǒng)骨修復(fù)材料的成骨活性，加速骨組織的再生與修復(fù)提供了一種簡單有效的策略。
原文信息：Qi Gan, Lina Chen, Ho-Pan Bei, Sze-Wing Ng, Han Guo, Guoqiang Liu, Hao Pan, Changsheng Liu, Xin Zhao, Zijian Zheng.
Artificial cilia for soft and stable surface covalent immobilization of bone morphogenetic protein-2.
Bioactive Materials, 24 (2023) 551-562.
京公網(wǎng)安備11010802046783號
